Διερεύνηση της παραγωγής αντιγονικών επιτόπων από την αμινοπεπτιδάση ERAP1 με βιβλιοθήκες πεπτιδίων και φασματοσκοπία μάζας συζευγμένη με υγρή χρωματογραφία (LC-MS/MS).

Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της επίκτητης ανοσίας είναι η αλληλεπίδραση των συστατικών της με συγκεκριμένα μόρια, τα αντιγόνα. Κατά την αντιγονοπαρουσίαση, ώριμοι αντιγονικοί επίτοποι παρουσιάζονται από τα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MCH), στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης προκειμένου να αναγνωριστούν από τα Τ λεμφοκύτταρα. Στην περίπτωση του ενδογενούς μονοπατιού της αντιγονοπαρουσίασης, οι αντιγονικοί επίτοποι αναγνωρίζονται από τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, με αποτέλεσμα την καταστροφή του κυττάρου. Με αυτόν τον τρόπο αφαιρούνται τα μολυσμένα ή τα καρκινικά κύτταρα. Στο μονοπάτι αυτό καθοριστικό ρόλο παίζουν οι αμινοπεπτιδάσες του ενδοπλασματικού δικτύου, η ERAP1 και η ERAP2 οι ο οποίες καταβολίζουν τα πρόδρομα πεπτίδια και παράγουν τους ώριμους αντιγονικούς επιτόπους που προσδένονται στα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξης I (MCH I) και αλληλεπιδρούν με ειδικούς υποδοχείς στα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. Συγκεκριμένα η αμινοπεπτιδάση ERAP1 υδρολύει στο Ν τελικό άκρο πεπτίδια μήκους 9 με 16 αμινοξέα προς το σχηματισμό ώριμων αντιγονικών επιτόπων μήκους 8 με 9 αμινοξικών καταλοίπων, ικανών να προσδεθούν στα νεοσυντιθέμενα μόρια MCH τάξης I. Το γονίδιο που κωδικοποιεί για την αμινοπεπτιδάση ERAP1 είναι πολυμορφικό, με τις διάφορες μονονουκλεοτιδικές παραλλαγές (SNVs) να οδηγούν σε διαφορετικές ισομορφές του ενζύμου (αλλότυπους), οι οποίες επηρεάζουν τη δραστικότητα της αμινοπεπτιδάσης. Οι πολυμορφισμοί του γονιδίου ERAP1 έχει βρεθεί ότι σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις, όπως τα αυτοάνοσα νοσήματα, καθώς και με περιπτώσεις καρκίνου. Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία είχε ως σκοπό τη διαλεύκανση του μηχανισμού, με τον οποίο η αμινοπεπτιδάση ERAP1 κόβει τα πρόδρομα αντιγονικά πεπτίδια, ανάλογα την αμινοξική αλληλουχία του πεπτιδίου. Στη συγκεκριμένη μελέτη αρχικά κατασκευαστήκαν δύο βιβλιοθήκες εννιαπεπτιδίων, όπου η μία είχε ως τελικό αμινοξύ τη λευκίνη και η δεύτερη τη λυσίνη, με σκοπό να επωαστούν με το ένζυμο. Για την κατασκευή των βιβλιοθηκών πραγματοποιήθηκε σύνθεση των πεπτιδίων σε στερεά φάση, η οποία σε αντίθεση με τη σύνθεση σε υγρή φάση έχει υψηλή απόδοση και δεν απαιτεί τον καθαρισμό των ενδιάμεσων προϊόντων σε κάθε στάδιο. Για την επίτευξη της σύνθεσης σε στερεά φάση χρησιμοποιήθηκαν 4 πολυμερή υποστρώματα ρητίνης και ισοκινητικό δείγμα που περιείχε τα αμινοξέα λευκίνη, λυσίνη, αλανίνη, ασπαρτικό οξύ και φαινυλαλανίνη. Η σύνθεση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με υψηλή απόδοση και για τις δύο βιβλιοθήκες, με τα αμινοξέα στα εννιαπεπτίδια να παρουσιάζουν τις αναμενόμενες αναλογίες ύστερα από μια πρώτη ανάλυση των βιβλιοθηκών, στο εργαστήριο πρωτεομικής του ΕΚΕΒΕ «Αλέξανδρος Φλέμινγκ», με τη χρήση timsTOF Ultra 2 συζευγμένο με το σύστημα nanoElute 2 UPLC. Από την ανάλυση επίσης ανιχνεύθηκαν περίπου 50.000 εννιαμερή, τα οποία στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε δύο ξεχωριστά μίγματα, όπου το ένα περιείχε την αμινοπεπτιδάση ERAP1, ενώ το δεύτερο δεν είχε το ένζυμο και χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας για την αντίδραση. Τα αποτελέσματα από την πέψη των πεπτιδίων από το ένζυμο αναλύθηκαν με τη χρήση διαγραμμάτων τύπου volcano, ενώ για τα εννιαμερή, καθώς και τα οκταμερή και επταμερή πεπτίδια που προέκυψαν από την επώαση με την αμινοπεπτιδάση πραγματοποιήθηκε ανάλυση με τη χρήση ραβδογραμμάτων και λογοτύπων ακολουθίας. Με τις δύο τελευταίες μεθόδους αναλύθηκαν και τα πεπτίδια που ανιχνεύθηκαν αποκλειστικά στο ένα από τα δύο μίγματα. Η ανάλυση ανέδειξε ένα σημαντικό τεχνικό πρόβλημα της προσέγγισης που σχετίζεται με την μεγάλη πολυπλοκότητα της βιβλιοθήκης και τη παρουσία μεγάλου αριθμού ισοβαρών πεπτιδίων. Παρά αυτά τα προβλήματα όμως, η ανάλυση ανέδειξε μια μέτρια εκλεκτικότητα του ενζύμου για συγκεκριμένες θέσης στην αμινοξική αλληλουχία που μπορεί να επηρεάζουν το πως διαμορφώνεται το ανοσοπεπτιδίωμα των κυττάρων.

Authors dc:creator

• Γουσγούνης Νικόλαος
• Gousgounis Nikolaos

• Θετικές Επιστήμες
• Science

Language dc:language

Ελληνικά, Greek

Identifier

uoadl:5357721

OAI identifier oai:identifier

oai:lib.uoa.gr:uoadl:5357721