{"id":{"repo_id":"athens","oai_identifier":"oai:lib.uoa.gr:uoadl:5357721"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/athens/oai:lib.uoa.gr:uoadl:5357721","repository":{"repo_id":"athens","name":"National and Kapodistrian University of Athens","base_url":"https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/frontend/oaipmh"},"display":{"title":"Διερεύνηση της παραγωγής αντιγονικών επιτόπων από την αμινοπεπτιδάση ERAP1 με βιβλιοθήκες πεπτιδίων και φασματοσκοπία μάζας συζευγμένη με υγρή χρωματογραφία (LC-MS/MS).","abstract":"Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της επίκτητης ανοσίας είναι η αλληλεπίδραση των συστατικών της με συγκεκριμένα μόρια, τα αντιγόνα. Κατά την αντιγονοπαρουσίαση, ώριμοι αντιγονικοί επίτοποι παρουσιάζονται από τα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MCH), στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης προκειμένου να αναγνωριστούν από τα Τ λεμφοκύτταρα. Στην περίπτωση του ενδογενούς μονοπατιού της αντιγονοπαρουσίασης, οι αντιγονικοί επίτοποι αναγνωρίζονται από τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, με αποτέλεσμα την καταστροφή του κυττάρου. Με αυτόν τον τρόπο αφαιρούνται τα μολυσμένα ή τα καρκινικά κύτταρα. Στο μονοπάτι αυτό καθοριστικό ρόλο παίζουν οι αμινοπεπτιδάσες του ενδοπλασματικού δικτύου, η ERAP1 και η ERAP2 οι ο οποίες καταβολίζουν τα πρόδρομα πεπτίδια και παράγουν τους ώριμους αντιγονικούς επιτόπους που προσδένονται στα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξης I (MCH I) και αλληλεπιδρούν με ειδικούς υποδοχείς στα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. Συγκεκριμένα η αμινοπεπτιδάση ERAP1 υδρολύει στο Ν τελικό άκρο πεπτίδια μήκους 9 με 16 αμινοξέα προς το σχηματισμό ώριμων αντιγονικών επιτόπων μήκους 8 με 9 αμινοξικών καταλοίπων, ικανών να προσδεθούν στα νεοσυντιθέμενα μόρια MCH τάξης I. Το γονίδιο που κωδικοποιεί για την αμινοπεπτιδάση ERAP1 είναι πολυμορφικό, με τις διάφορες μονονουκλεοτιδικές παραλλαγές (SNVs) να οδηγούν σε διαφορετικές ισομορφές του ενζύμου (αλλότυπους), οι οποίες επηρεάζουν τη δραστικότητα της αμινοπεπτιδάσης. Οι πολυμορφισμοί του γονιδίου ERAP1 έχει βρεθεί ότι σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις, όπως τα αυτοάνοσα νοσήματα, καθώς και με περιπτώσεις καρκίνου. Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία είχε ως σκοπό τη διαλεύκανση του μηχανισμού, με τον οποίο η αμινοπεπτιδάση ERAP1 κόβει τα πρόδρομα αντιγονικά πεπτίδια, ανάλογα την αμινοξική αλληλουχία του πεπτιδίου. Στη συγκεκριμένη μελέτη αρχικά κατασκευαστήκαν δύο βιβλιοθήκες εννιαπεπτιδίων, όπου η μία είχε ως τελικό αμινοξύ τη λευκίνη και η δεύτερη τη λυσίνη, με σκοπό να επωαστούν με το ένζυμο. Για την κατασκευή των βιβλιοθηκών πραγματοποιήθηκε σύνθεση των πεπτιδίων σε στερεά φάση, η οποία σε αντίθεση με τη σύνθεση σε υγρή φάση έχει υψηλή απόδοση και δεν απαιτεί τον καθαρισμό των ενδιάμεσων προϊόντων σε κάθε στάδιο. Για την επίτευξη της σύνθεσης σε στερεά φάση χρησιμοποιήθηκαν 4 πολυμερή υποστρώματα ρητίνης και ισοκινητικό δείγμα που περιείχε τα αμινοξέα λευκίνη, λυσίνη, αλανίνη, ασπαρτικό οξύ και φαινυλαλανίνη. Η σύνθεση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με υψηλή απόδοση και για τις δύο βιβλιοθήκες, με τα αμινοξέα στα εννιαπεπτίδια να παρουσιάζουν τις αναμενόμενες αναλογίες ύστερα από μια πρώτη ανάλυση των βιβλιοθηκών, στο εργαστήριο πρωτεομικής του ΕΚΕΒΕ «Αλέξανδρος Φλέμινγκ», με τη χρήση timsTOF Ultra 2 συζευγμένο με το σύστημα nanoElute 2 UPLC. Από την ανάλυση επίσης ανιχνεύθηκαν περίπου 50.000 εννιαμερή, τα οποία στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε δύο ξεχωριστά μίγματα, όπου το ένα περιείχε την αμινοπεπτιδάση ERAP1, ενώ το δεύτερο δεν είχε το ένζυμο και χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας για την αντίδραση. Τα αποτελέσματα από την πέψη των πεπτιδίων από το ένζυμο αναλύθηκαν με τη χρήση διαγραμμάτων τύπου volcano, ενώ για τα εννιαμερή, καθώς και τα οκταμερή και επταμερή πεπτίδια που προέκυψαν από την επώαση με την αμινοπεπτιδάση πραγματοποιήθηκε ανάλυση με τη χρήση ραβδογραμμάτων και λογοτύπων ακολουθίας. Με τις δύο τελευταίες μεθόδους αναλύθηκαν και τα πεπτίδια που ανιχνεύθηκαν αποκλειστικά στο ένα από τα δύο μίγματα. Η ανάλυση ανέδειξε ένα σημαντικό τεχνικό πρόβλημα της προσέγγισης που σχετίζεται με την μεγάλη πολυπλοκότητα της βιβλιοθήκης και τη παρουσία μεγάλου αριθμού ισοβαρών πεπτιδίων. Παρά αυτά τα προβλήματα όμως, η ανάλυση ανέδειξε μια μέτρια εκλεκτικότητα του ενζύμου για συγκεκριμένες θέσης στην αμινοξική αλληλουχία που μπορεί να επηρεάζουν το πως διαμορφώνεται το ανοσοπεπτιδίωμα των κυττάρων.","abstract_html":"Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της επίκτητης ανοσίας είναι η αλληλεπίδραση των συστατικών της με συγκεκριμένα μόρια, τα αντιγόνα. Κατά την αντιγονοπαρουσίαση, ώριμοι αντιγονικοί επίτοποι παρουσιάζονται από τα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MCH), στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης προκειμένου να αναγνωριστούν από τα Τ λεμφοκύτταρα. Στην περίπτωση του ενδογενούς μονοπατιού της αντιγονοπαρουσίασης, οι αντιγονικοί επίτοποι αναγνωρίζονται από τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, με αποτέλεσμα την καταστροφή του κυττάρου. Με αυτόν τον τρόπο αφαιρούνται τα μολυσμένα ή τα καρκινικά κύτταρα. Στο μονοπάτι αυτό καθοριστικό ρόλο παίζουν οι αμινοπεπτιδάσες του ενδοπλασματικού δικτύου, η ERAP1 και η ERAP2 οι ο οποίες καταβολίζουν τα πρόδρομα πεπτίδια και παράγουν τους ώριμους αντιγονικούς επιτόπους που προσδένονται στα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξης I (MCH I) και αλληλεπιδρούν με ειδικούς υποδοχείς στα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. Συγκεκριμένα η αμινοπεπτιδάση ERAP1 υδρολύει στο Ν τελικό άκρο πεπτίδια μήκους 9 με 16 αμινοξέα προς το σχηματισμό ώριμων αντιγονικών επιτόπων μήκους 8 με 9 αμινοξικών καταλοίπων, ικανών να προσδεθούν στα νεοσυντιθέμενα μόρια MCH τάξης I. Το γονίδιο που κωδικοποιεί για την αμινοπεπτιδάση ERAP1 είναι πολυμορφικό, με τις διάφορες μονονουκλεοτιδικές παραλλαγές (SNVs) να οδηγούν σε διαφορετικές ισομορφές του ενζύμου (αλλότυπους), οι οποίες επηρεάζουν τη δραστικότητα της αμινοπεπτιδάσης. Οι πολυμορφισμοί του γονιδίου ERAP1 έχει βρεθεί ότι σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις, όπως τα αυτοάνοσα νοσήματα, καθώς και με περιπτώσεις καρκίνου. Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία είχε ως σκοπό τη διαλεύκανση του μηχανισμού, με τον οποίο η αμινοπεπτιδάση ERAP1 κόβει τα πρόδρομα αντιγονικά πεπτίδια, ανάλογα την αμινοξική αλληλουχία του πεπτιδίου. Στη συγκεκριμένη μελέτη αρχικά κατασκευαστήκαν δύο βιβλιοθήκες εννιαπεπτιδίων, όπου η μία είχε ως τελικό αμινοξύ τη λευκίνη και η δεύτερη τη λυσίνη, με σκοπό να επωαστούν με το ένζυμο. Για την κατασκευή των βιβλιοθηκών πραγματοποιήθηκε σύνθεση των πεπτιδίων σε στερεά φάση, η οποία σε αντίθεση με τη σύνθεση σε υγρή φάση έχει υψηλή απόδοση και δεν απαιτεί τον καθαρισμό των ενδιάμεσων προϊόντων σε κάθε στάδιο. Για την επίτευξη της σύνθεσης σε στερεά φάση χρησιμοποιήθηκαν 4 πολυμερή υποστρώματα ρητίνης και ισοκινητικό δείγμα που περιείχε τα αμινοξέα λευκίνη, λυσίνη, αλανίνη, ασπαρτικό οξύ και φαινυλαλανίνη. Η σύνθεση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με υψηλή απόδοση και για τις δύο βιβλιοθήκες, με τα αμινοξέα στα εννιαπεπτίδια να παρουσιάζουν τις αναμενόμενες αναλογίες ύστερα από μια πρώτη ανάλυση των βιβλιοθηκών, στο εργαστήριο πρωτεομικής του ΕΚΕΒΕ «Αλέξανδρος Φλέμινγκ», με τη χρήση timsTOF Ultra 2 συζευγμένο με το σύστημα nanoElute 2 UPLC. Από την ανάλυση επίσης ανιχνεύθηκαν περίπου 50.000 εννιαμερή, τα οποία στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε δύο ξεχωριστά μίγματα, όπου το ένα περιείχε την αμινοπεπτιδάση ERAP1, ενώ το δεύτερο δεν είχε το ένζυμο και χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας για την αντίδραση. Τα αποτελέσματα από την πέψη των πεπτιδίων από το ένζυμο αναλύθηκαν με τη χρήση διαγραμμάτων τύπου volcano, ενώ για τα εννιαμερή, καθώς και τα οκταμερή και επταμερή πεπτίδια που προέκυψαν από την επώαση με την αμινοπεπτιδάση πραγματοποιήθηκε ανάλυση με τη χρήση ραβδογραμμάτων και λογοτύπων ακολουθίας. Με τις δύο τελευταίες μεθόδους αναλύθηκαν και τα πεπτίδια που ανιχνεύθηκαν αποκλειστικά στο ένα από τα δύο μίγματα. Η ανάλυση ανέδειξε ένα σημαντικό τεχνικό πρόβλημα της προσέγγισης που σχετίζεται με την μεγάλη πολυπλοκότητα της βιβλιοθήκης και τη παρουσία μεγάλου αριθμού ισοβαρών πεπτιδίων. Παρά αυτά τα προβλήματα όμως, η ανάλυση ανέδειξε μια μέτρια εκλεκτικότητα του ενζύμου για συγκεκριμένες θέσης στην αμινοξική αλληλουχία που μπορεί να επηρεάζουν το πως διαμορφώνεται το ανοσοπεπτιδίωμα των κυττάρων.","abstract_has_math":false,"creators":["Γουσγούνης Νικόλαος","Gousgounis Nikolaos"],"institution":null,"degree_name":null,"degree_level":null,"degree_discipline":null,"degree_department":null,"school":null,"contributors":[],"advisors":[],"committee_chairs":[],"committee_members":[],"year":2026,"date_issued":"2026","date_published":"2026","updated_at":"2026-07-24T01:01:45Z","subjects":["Θετικές Επιστήμες","Science"],"languages":["Ελληνικά","Greek"],"rights":[],"rights_urls":[],"identifier_entries":[{"key":"dc:identifier","label":"Identifier","values":["uoadl:5357721"],"render_values":[{"text":"uoadl:5357721","href":null,"code":true}]}]},"links":{"outbound_url":"https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/5357721","outbound_label":"Repository record","outbound_source":"dc:identifier"},"metadata_groups":[{"id":"people","label":"People","entries":[{"key":"dc:creator","label":"Author","values":["Γουσγούνης Νικόλαος","Gousgounis Nikolaos"]}]},{"id":"academic_context","label":"Academic Context","entries":[{"key":"dc:date","label":"Dc Date","values":["2026"]},{"key":"dc:type","label":"Dc Type","values":["born_digital_postgraduate_thesis","Διπλωματική Εργασία","Postgraduate Thesis"]}]},{"id":"subjects_keywords","label":"Subjects and Keywords","entries":[{"key":"dc:subject","label":"Dc Subject","values":["Θετικές Επιστήμες","Science"]}]},{"id":"language_rights","label":"Language and Rights","entries":[{"key":"dc:language","label":"Dc Language","values":["Ελληνικά","Greek"]}]},{"id":"identifiers","label":"Identifiers","entries":[{"key":"dc:identifier","label":"Identifier","values":["uoadl:5357721","https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/5357721"]}]},{"id":"additional","label":"Additional Metadata","entries":[{"key":"dc:description","label":"Description","values":["Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της επίκτητης ανοσίας είναι η αλληλεπίδραση των συστατικών της με συγκεκριμένα μόρια, τα αντιγόνα. Κατά την αντιγονοπαρουσίαση, ώριμοι αντιγονικοί επίτοποι παρουσιάζονται από τα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MCH), στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης προκειμένου να αναγνωριστούν από τα Τ λεμφοκύτταρα. Στην περίπτωση του ενδογενούς μονοπατιού της αντιγονοπαρουσίασης, οι αντιγονικοί επίτοποι αναγνωρίζονται από τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, με αποτέλεσμα την καταστροφή του κυττάρου. Με αυτόν τον τρόπο αφαιρούνται τα μολυσμένα ή τα καρκινικά κύτταρα. Στο μονοπάτι αυτό καθοριστικό ρόλο παίζουν οι αμινοπεπτιδάσες του ενδοπλασματικού δικτύου, η ERAP1 και η ERAP2 οι ο οποίες καταβολίζουν τα πρόδρομα πεπτίδια και παράγουν τους ώριμους αντιγονικούς επιτόπους που προσδένονται στα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξης I (MCH I) και αλληλεπιδρούν με ειδικούς υποδοχείς στα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. Συγκεκριμένα η αμινοπεπτιδάση ERAP1 υδρολύει στο Ν τελικό άκρο πεπτίδια μήκους 9 με 16 αμινοξέα προς το σχηματισμό ώριμων αντιγονικών επιτόπων μήκους 8 με 9 αμινοξικών καταλοίπων, ικανών να προσδεθούν στα νεοσυντιθέμενα μόρια MCH τάξης I. Το γονίδιο που κωδικοποιεί για την αμινοπεπτιδάση ERAP1 είναι πολυμορφικό, με τις διάφορες μονονουκλεοτιδικές παραλλαγές (SNVs) να οδηγούν σε διαφορετικές ισομορφές του ενζύμου (αλλότυπους), οι οποίες επηρεάζουν τη δραστικότητα της αμινοπεπτιδάσης. Οι πολυμορφισμοί του γονιδίου ERAP1 έχει βρεθεί ότι σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις, όπως τα αυτοάνοσα νοσήματα, καθώς και με περιπτώσεις καρκίνου. Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία είχε ως σκοπό τη διαλεύκανση του μηχανισμού, με τον οποίο η αμινοπεπτιδάση ERAP1 κόβει τα πρόδρομα αντιγονικά πεπτίδια, ανάλογα την αμινοξική αλληλουχία του πεπτιδίου. Στη συγκεκριμένη μελέτη αρχικά κατασκευαστήκαν δύο βιβλιοθήκες εννιαπεπτιδίων, όπου η μία είχε ως τελικό αμινοξύ τη λευκίνη και η δεύτερη τη λυσίνη, με σκοπό να επωαστούν με το ένζυμο. Για την κατασκευή των βιβλιοθηκών πραγματοποιήθηκε σύνθεση των πεπτιδίων σε στερεά φάση, η οποία σε αντίθεση με τη σύνθεση σε υγρή φάση έχει υψηλή απόδοση και δεν απαιτεί τον καθαρισμό των ενδιάμεσων προϊόντων σε κάθε στάδιο. Για την επίτευξη της σύνθεσης σε στερεά φάση χρησιμοποιήθηκαν 4 πολυμερή υποστρώματα ρητίνης και ισοκινητικό δείγμα που περιείχε τα αμινοξέα λευκίνη, λυσίνη, αλανίνη, ασπαρτικό οξύ και φαινυλαλανίνη. Η σύνθεση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με υψηλή απόδοση και για τις δύο βιβλιοθήκες, με τα αμινοξέα στα εννιαπεπτίδια να παρουσιάζουν τις αναμενόμενες αναλογίες ύστερα από μια πρώτη ανάλυση των βιβλιοθηκών, στο εργαστήριο πρωτεομικής του ΕΚΕΒΕ «Αλέξανδρος Φλέμινγκ», με τη χρήση timsTOF Ultra 2 συζευγμένο με το σύστημα nanoElute 2 UPLC. Από την ανάλυση επίσης ανιχνεύθηκαν περίπου 50.000 εννιαμερή, τα οποία στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε δύο ξεχωριστά μίγματα, όπου το ένα περιείχε την αμινοπεπτιδάση ERAP1, ενώ το δεύτερο δεν είχε το ένζυμο και χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας για την αντίδραση. Τα αποτελέσματα από την πέψη των πεπτιδίων από το ένζυμο αναλύθηκαν με τη χρήση διαγραμμάτων τύπου volcano, ενώ για τα εννιαμερή, καθώς και τα οκταμερή και επταμερή πεπτίδια που προέκυψαν από την επώαση με την αμινοπεπτιδάση πραγματοποιήθηκε ανάλυση με τη χρήση ραβδογραμμάτων και λογοτύπων ακολουθίας. Με τις δύο τελευταίες μεθόδους αναλύθηκαν και τα πεπτίδια που ανιχνεύθηκαν αποκλειστικά στο ένα από τα δύο μίγματα. Η ανάλυση ανέδειξε ένα σημαντικό τεχνικό πρόβλημα της προσέγγισης που σχετίζεται με την μεγάλη πολυπλοκότητα της βιβλιοθήκης και τη παρουσία μεγάλου αριθμού ισοβαρών πεπτιδίων. Παρά αυτά τα προβλήματα όμως, η ανάλυση ανέδειξε μια μέτρια εκλεκτικότητα του ενζύμου για συγκεκριμένες θέσης στην αμινοξική αλληλουχία που μπορεί να επηρεάζουν το πως διαμορφώνεται το ανοσοπεπτιδίωμα των κυττάρων.","One of the main characteristics of acquired immunity is the interaction of its components with specific molecules, the antigens. During antigen presentation, mature antigenic epitopes are presented by major histocompatibility complex (MCH) molecules on the outer surface of the cell membrane for recognition by T lymphocytes. In the case of the endogenous antigen presentation pathway, antigenic epitopes are recognized by cytotoxic T lymphocytes, resulting in the destruction of the cell. In this way, infected or cancerous cells are removed. In this pathway, the endoplasmic reticulum aminopeptidases, ERAP1 and ERAP2, play a crucial role, catalyzing the precursor peptides and producing the mature antigenic epitopes that bind to major histocompatibility complex class I (MCH I) molecules and interact with specific receptors on cytotoxic T cells. Specifically, the aminopeptidase ERAP1 hydrolyzes peptides of 9 to 16 amino acids in length at the N terminus to form mature antigenic epitopes of 8 to 9 amino acid residues in length, capable of binding to newly synthesized MCH class I molecules. The gene encoding the aminopeptidase ERAP1 is polymorphic, with various single nucleotide variants (SNVs) leading to different isoforms of the enzyme (allotypes), which affect the activity of the aminopeptidase. Polymorphisms of the ERAP1 gene have been found to be associated with pathological conditions, such as autoimmune diseases, as well as with cases of cancer. The present postgraduate thesis aimed to elucidate the mechanism by which the aminopeptidase ERAP1 cleaves precursor antigenic peptides, depending on the amino acid sequence of the peptide. In this study, two libraries of 9mer-peptides were initially constructed, one with leucine as the c-terminal amino acid and the other with lysine, for incubation with the enzyme. For the construction of the libraries, solid-phase peptide synthesis was performed, which, unlike liquid-phase synthesis, has high yield and does not require the purification of intermediates at each stage. To achieve solid phase synthesis, 4 polymer resin substrates and an isokinetic sample containing the amino acids leucine, lysine, alanine, aspartic acid and phenylalanine were used. Peptide synthesis was performed with high efficiency for both libraries, with the amino acids in the 9mer-peptides presenting the expected ratios after a first analysis of the libraries, at the proteomics laboratory of the "Alexander Fleming" National Cancer Institute, using timsTOF Ultra 2 coupled with the nanoElute 2 UPLC system. The analysis also detected approximately 50,000 9mers, which were then placed in two separate mixtures, one containing the aminopeptidase ERAP1, while the second did not have the enzyme and was used as a control for the reaction. The results of the digestion of peptides by the enzyme were analyzed using volcano-type diagrams, while for the 9mer and smaller peptides resulting from the incubation with aminopeptidase, analysis was performed using bar graphs and sequence logos. The last two methods also analyzed the peptides that were detected exclusively in one of the two mixtures. The analysis revealed a significant technical problem with the approach related to the high complexity of the library and the presence of a large number of isobaric peptides. Despite these problems, however, the analysis revealed a moderate selectivity of the enzyme for specific positions in the amino acid sequence that may influence how the immunopeptide profile of cells is formed."]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Διερεύνηση της παραγωγής αντιγονικών επιτόπων από την αμινοπεπτιδάση ERAP1 με βιβλιοθήκες πεπτιδίων και φασματοσκοπία μάζας συζευγμένη με υγρή χρωματογραφία (LC-MS/MS)."]}]}],"canonical_facts":{"dc:creator":["Γουσγούνης Νικόλαος","Gousgounis Nikolaos"],"dc:date":["2026"],"dc:description":["Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της επίκτητης ανοσίας είναι η αλληλεπίδραση των συστατικών της με συγκεκριμένα μόρια, τα αντιγόνα. Κατά την αντιγονοπαρουσίαση, ώριμοι αντιγονικοί επίτοποι παρουσιάζονται από τα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MCH), στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης προκειμένου να αναγνωριστούν από τα Τ λεμφοκύτταρα. Στην περίπτωση του ενδογενούς μονοπατιού της αντιγονοπαρουσίασης, οι αντιγονικοί επίτοποι αναγνωρίζονται από τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, με αποτέλεσμα την καταστροφή του κυττάρου. Με αυτόν τον τρόπο αφαιρούνται τα μολυσμένα ή τα καρκινικά κύτταρα. Στο μονοπάτι αυτό καθοριστικό ρόλο παίζουν οι αμινοπεπτιδάσες του ενδοπλασματικού δικτύου, η ERAP1 και η ERAP2 οι ο οποίες καταβολίζουν τα πρόδρομα πεπτίδια και παράγουν τους ώριμους αντιγονικούς επιτόπους που προσδένονται στα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξης I (MCH I) και αλληλεπιδρούν με ειδικούς υποδοχείς στα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. Συγκεκριμένα η αμινοπεπτιδάση ERAP1 υδρολύει στο Ν τελικό άκρο πεπτίδια μήκους 9 με 16 αμινοξέα προς το σχηματισμό ώριμων αντιγονικών επιτόπων μήκους 8 με 9 αμινοξικών καταλοίπων, ικανών να προσδεθούν στα νεοσυντιθέμενα μόρια MCH τάξης I. Το γονίδιο που κωδικοποιεί για την αμινοπεπτιδάση ERAP1 είναι πολυμορφικό, με τις διάφορες μονονουκλεοτιδικές παραλλαγές (SNVs) να οδηγούν σε διαφορετικές ισομορφές του ενζύμου (αλλότυπους), οι οποίες επηρεάζουν τη δραστικότητα της αμινοπεπτιδάσης. Οι πολυμορφισμοί του γονιδίου ERAP1 έχει βρεθεί ότι σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις, όπως τα αυτοάνοσα νοσήματα, καθώς και με περιπτώσεις καρκίνου. Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία είχε ως σκοπό τη διαλεύκανση του μηχανισμού, με τον οποίο η αμινοπεπτιδάση ERAP1 κόβει τα πρόδρομα αντιγονικά πεπτίδια, ανάλογα την αμινοξική αλληλουχία του πεπτιδίου. Στη συγκεκριμένη μελέτη αρχικά κατασκευαστήκαν δύο βιβλιοθήκες εννιαπεπτιδίων, όπου η μία είχε ως τελικό αμινοξύ τη λευκίνη και η δεύτερη τη λυσίνη, με σκοπό να επωαστούν με το ένζυμο. Για την κατασκευή των βιβλιοθηκών πραγματοποιήθηκε σύνθεση των πεπτιδίων σε στερεά φάση, η οποία σε αντίθεση με τη σύνθεση σε υγρή φάση έχει υψηλή απόδοση και δεν απαιτεί τον καθαρισμό των ενδιάμεσων προϊόντων σε κάθε στάδιο. Για την επίτευξη της σύνθεσης σε στερεά φάση χρησιμοποιήθηκαν 4 πολυμερή υποστρώματα ρητίνης και ισοκινητικό δείγμα που περιείχε τα αμινοξέα λευκίνη, λυσίνη, αλανίνη, ασπαρτικό οξύ και φαινυλαλανίνη. Η σύνθεση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με υψηλή απόδοση και για τις δύο βιβλιοθήκες, με τα αμινοξέα στα εννιαπεπτίδια να παρουσιάζουν τις αναμενόμενες αναλογίες ύστερα από μια πρώτη ανάλυση των βιβλιοθηκών, στο εργαστήριο πρωτεομικής του ΕΚΕΒΕ «Αλέξανδρος Φλέμινγκ», με τη χρήση timsTOF Ultra 2 συζευγμένο με το σύστημα nanoElute 2 UPLC. Από την ανάλυση επίσης ανιχνεύθηκαν περίπου 50.000 εννιαμερή, τα οποία στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε δύο ξεχωριστά μίγματα, όπου το ένα περιείχε την αμινοπεπτιδάση ERAP1, ενώ το δεύτερο δεν είχε το ένζυμο και χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας για την αντίδραση. Τα αποτελέσματα από την πέψη των πεπτιδίων από το ένζυμο αναλύθηκαν με τη χρήση διαγραμμάτων τύπου volcano, ενώ για τα εννιαμερή, καθώς και τα οκταμερή και επταμερή πεπτίδια που προέκυψαν από την επώαση με την αμινοπεπτιδάση πραγματοποιήθηκε ανάλυση με τη χρήση ραβδογραμμάτων και λογοτύπων ακολουθίας. Με τις δύο τελευταίες μεθόδους αναλύθηκαν και τα πεπτίδια που ανιχνεύθηκαν αποκλειστικά στο ένα από τα δύο μίγματα. Η ανάλυση ανέδειξε ένα σημαντικό τεχνικό πρόβλημα της προσέγγισης που σχετίζεται με την μεγάλη πολυπλοκότητα της βιβλιοθήκης και τη παρουσία μεγάλου αριθμού ισοβαρών πεπτιδίων. Παρά αυτά τα προβλήματα όμως, η ανάλυση ανέδειξε μια μέτρια εκλεκτικότητα του ενζύμου για συγκεκριμένες θέσης στην αμινοξική αλληλουχία που μπορεί να επηρεάζουν το πως διαμορφώνεται το ανοσοπεπτιδίωμα των κυττάρων.","One of the main characteristics of acquired immunity is the interaction of its components with specific molecules, the antigens. During antigen presentation, mature antigenic epitopes are presented by major histocompatibility complex (MCH) molecules on the outer surface of the cell membrane for recognition by T lymphocytes. In the case of the endogenous antigen presentation pathway, antigenic epitopes are recognized by cytotoxic T lymphocytes, resulting in the destruction of the cell. In this way, infected or cancerous cells are removed. In this pathway, the endoplasmic reticulum aminopeptidases, ERAP1 and ERAP2, play a crucial role, catalyzing the precursor peptides and producing the mature antigenic epitopes that bind to major histocompatibility complex class I (MCH I) molecules and interact with specific receptors on cytotoxic T cells. Specifically, the aminopeptidase ERAP1 hydrolyzes peptides of 9 to 16 amino acids in length at the N terminus to form mature antigenic epitopes of 8 to 9 amino acid residues in length, capable of binding to newly synthesized MCH class I molecules. The gene encoding the aminopeptidase ERAP1 is polymorphic, with various single nucleotide variants (SNVs) leading to different isoforms of the enzyme (allotypes), which affect the activity of the aminopeptidase. Polymorphisms of the ERAP1 gene have been found to be associated with pathological conditions, such as autoimmune diseases, as well as with cases of cancer. The present postgraduate thesis aimed to elucidate the mechanism by which the aminopeptidase ERAP1 cleaves precursor antigenic peptides, depending on the amino acid sequence of the peptide. In this study, two libraries of 9mer-peptides were initially constructed, one with leucine as the c-terminal amino acid and the other with lysine, for incubation with the enzyme. For the construction of the libraries, solid-phase peptide synthesis was performed, which, unlike liquid-phase synthesis, has high yield and does not require the purification of intermediates at each stage. To achieve solid phase synthesis, 4 polymer resin substrates and an isokinetic sample containing the amino acids leucine, lysine, alanine, aspartic acid and phenylalanine were used. Peptide synthesis was performed with high efficiency for both libraries, with the amino acids in the 9mer-peptides presenting the expected ratios after a first analysis of the libraries, at the proteomics laboratory of the "Alexander Fleming" National Cancer Institute, using timsTOF Ultra 2 coupled with the nanoElute 2 UPLC system. The analysis also detected approximately 50,000 9mers, which were then placed in two separate mixtures, one containing the aminopeptidase ERAP1, while the second did not have the enzyme and was used as a control for the reaction. The results of the digestion of peptides by the enzyme were analyzed using volcano-type diagrams, while for the 9mer and smaller peptides resulting from the incubation with aminopeptidase, analysis was performed using bar graphs and sequence logos. The last two methods also analyzed the peptides that were detected exclusively in one of the two mixtures. The analysis revealed a significant technical problem with the approach related to the high complexity of the library and the presence of a large number of isobaric peptides. Despite these problems, however, the analysis revealed a moderate selectivity of the enzyme for specific positions in the amino acid sequence that may influence how the immunopeptide profile of cells is formed."],"dc:identifier":["uoadl:5357721","https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/5357721"],"dc:language":["Ελληνικά","Greek"],"dc:subject":["Θετικές Επιστήμες","Science"],"dc:title":["Διερεύνηση της παραγωγής αντιγονικών επιτόπων από την αμινοπεπτιδάση ERAP1 με βιβλιοθήκες πεπτιδίων και φασματοσκοπία μάζας συζευγμένη με υγρή χρωματογραφία (LC-MS/MS)."],"dc:type":["born_digital_postgraduate_thesis","Διπλωματική Εργασία","Postgraduate Thesis"]},"updated_at":"2026-07-24T01:01:45Z"}