Μελέτη της έκφρασης και ρύθμισης της L-Dopa Αποκαρβοξυλάσης σε Bιοχημικούς μηχανισμούς Νευροεκφυλισμού

Η παρούσα ερευνητική εργασία εκπονήθηκε στην Ερευνητική Μονάδα Ι του Τομέα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας του Τμήματος Βιολογίας, υπό την επίβλεψη της αναπληρώτριας καθηγήτριας Δρ. Διδώ Βασιλακοπούλου και του μέλους ΕΔΙΠ, Δρ. Νικόλαου Αρβανίτη. Εντάσσεται στα πλαίσια του μαθήματος «Διπλωματική Εργασία» του προγράμματος μεταπτυχιακών σπουδών «Κλινική Βιοχημεία – Μοριακή Διαγνωστική » του Τμήματος Βιολογίας του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών. Η ερευνητική μας ομάδα μέχρι τώρα έχει δείξει με τη μελέτη του μορίου της L-DOPA αποκαρβοξυλάσης ότι συμμετέχει τόσο στον αποπτωτικό θάνατο όσο και σε διεργασίες κυτταροτοξικότητας . Πρόσφατα δεδομένα της ερευνητικής μας ομάδας, έδειξαν τη σχέση της έκφρασης της L-DOPA αποκαρβοξυλάσης με την οξειδωτική καταπόνηση. Ακόμη και σε υψηλές ποσότητες Η2Ο2 τα αποτελέσματά μας με qPCR επέδειξαν αύξηση και στα επίπεδα έκφρασης του mRNA της DDC (Lotsios et al. 2023). Για την επίτευξη αυτού του στόχου επιλέχθηκαν δύο κυτταρικές σειρές, οι CHO και CHO-DDC. Τα κύτταρα CHO αποτελούν μοντέλα έρευνας για τη δράση των κατεχολαμινών, καθώς δεν εκφράζουν τις πρωτεΐνες-μεταφορείς τους (Costello et al. 2012; Percy et al. 1999). Η κυτταρική σειρά CHO-DDC δημιουργήθηκε στο εργαστήριο της κυρίας Βασιλακοπούλου, όπου κύτταρα CHO επιμολύνθηκαν με το cDNA της ανθρώπινης L-DOPA αποκαρβοξυλάσης πλήρους μήκους. Η DDC έχει πολυάριθμες ισομορφές και καταφέραμε να απομονώσουμε την L-DOPA αποκαρβοξυλάση πλήρους μήκους με την οποία πραγματοποιήθηκε επιμόλυνση στην κυτταρική σειρά CHO. Προς αυτή την κατεύθυνση, ο ερευνητικός στόχος ήταν να μελετήσουμε το φαινόμενο της συσχέτισης της έκφρασης της DDC με την οξειδωτική καταπόνηση ως σύστημα το οποίο έχει αναπτυχθεί στο εργαστήριο μας. Πρώτο βήμα της πειραματικής πορείας αποτέλεσε η εξακρίβωση της συμμετοχής αυξανόμενων συγκεντρώσεων H2O2 στην επαγωγή οξειδωτικού στρες στις επιλεγμένες κυτταρικές σειρές. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα ποσοτικού προσδιορισμού κυτταροτοξικότητας σε κυτταρικές καλλιέργειες που είχαν αναπτυχθεί για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων H2O2, με απώτερο σκοπό τον προσδιορισμό των διαφορών στις τιμές κυτταρικού θανάτου συναρτήσει της αύξησης της συγκέντρωσης του οξειδωτικού παράγοντα. Αφού επιβεβαιώθηκε η σχέση του H2O2 στην επαγωγή οξειδωτικών συνθηκών, μελετήθηκε το πρότυπο πρωτεϊνικής έκφρασης του μορίου της DDC, κάτω από αυτές τις συνθήκες Ο προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε μέσω ανοσοστύπωσης κατά Western. Σκοπός της πειραματικής πορείας ήταν ο εντοπισμός τυχών μεταβολών στην ποσοτική έκφραση της πρωτεΐνης καθώς και στο πρότυπο αποικοδόμησής της. Εκτός από το H2O2 οι δυο παραπάνω κυτταρικές σειρές εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις ρυθμιστικών παραγόντων του ενζύμου της DDC όπως ο αναστολέας Carbidopa και ο νευροδιαβιβαστής ντοπαμίνη . Μελετήθηκε τόσο η κυτταροτοξικότητα όσο και το πρότυπο πρωτεϊνικής έκφρασης του μορίου της DDC. Ακολούθησε προσθήκη H2O2 ως οξειδωτικό παράγοντα μαζί με ρυθμιστικό παράγοντα της DDC σε κάθε κυτταρική σειρά ώστε να διερευνηθεί η κυτταροτοξικότητα και η πρωτεϊνική έκφραση όταν συνυπάρχουν και οι δυο παράγοντες. Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας είναι η συσχέτιση όλων των προαναφερθέντων δεδομένων προς τη διαλεύκανση του ρόλου της DDC στην ανάπτυξη του οξειδωτικού στρες .

Authors dc:creator

• ΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΑΦΡΟΔΙΤΗ
• DIMITRIOU AFRODITI

• Θετικές Επιστήμες
• Science

Language dc:language

Ελληνικά, Greek

Identifier

uoadl:5375233

OAI identifier oai:identifier

oai:lib.uoa.gr:uoadl:5375233