The anti-biofilm activity of essential oils on Listeria monocytogenesand Salmonella Enteritidis

[SPA] La mayoría de los alimentos representan un entorno fértil para el crecimiento de bacterias patógenas. En condiciones poco higiénicas, la contaminación causada por estos microorganismos podría resultar en brotes de enfermedades de transmisión alimentaria que afecten a la salud pública. Además, esta contaminación puede causar importantes pérdidas económicas a las industrias al tener que retirar el producto del mercado, lo cual afectará notablemente a su reputación. Por esta razón, las buenas prácticas de higiene deben mantenerse y controlarse desde la granja hasta la mesa. En otras palabras, se debe aplicar una desinfección adecuada, una buena manipulación y se debe cumplir la normativa durante la producción, procesado, transporte, distribución, venta y consumo. Listeria monocytogenes y Salmonella Enteritidis son dos de los retos más importantes para la industria alimentaria por diferentes razones. La listeriosis tiene una de las tasas de mortalidad más alta respeto a otros patógenos alimentarios y podría llegar a ser letal para los grupos más vulnerables. Otro problema asociado con L. monocytogenes, es su capacidad de multiplicarse a temperaturas de refrigeración. Salmonella spp. ha sido vinculada con la mayoría de los brotes de intoxicación alimentaria en la Unión Europea, siendo S. Enteritidis la serovariedad más predominante. Además, la salmonelosis puede llegar a ser grave poniendo en peligro a los humanos. Ambos patógenos pueden introducirse en la cadena alimentaria a través de materias primas, trabajadores y otras fuentes, ya que viven en varios hábitats. Además de eso, pueden formar biofilms sobre diferentes superficies, lo que hace que su presencia sea muy preocupante. Los biofilms son comunidades microbianas complejas unidas entre sí por una matriz extracelular polimérica. Las células que forman parte de un biofilm son más resistentes que sus formas planctónicas. Por lo general, los biofilms se forman en zonas inaccesibles de las plantas de procesado, ya que estas áreas no siempre se limpian bien. Por lo tanto, pueden persistir durante mucho tiempo provocando problemas y contaminación. Se ha aplicado protocolos de limpieza y desinfección empleando varios productos comerciales con el objetivo de eliminar los biofilms. Sin embargo, el uso de estos productos está cuestionado, ya que acarrea algunos problemas adicionales. Primero, su uso repetido y especialmente la exposición a concentraciones subletales pueden generar resistencia. En segundo lugar, este tipo de sustancias químicas no son muy respetuosas con el medio ambiente, lo que las convierte en poco deseables. Así pues, la investigación y la búsqueda de alternativas naturales se ha ido incrementando año tras año para responder a las demandas del consumidor. Entre estas alternativas, los aceites esenciales (AE) se consideran una opción natural y ecológica. La actividad de estas sustancias volátiles y aromáticas se ha descrito ampliamente en la literatura. Entre los AE, los de canela, clavo, cebolla y ajo han sido utilizados en diferentes culturas, en forma de aditivos naturales, para prevenir el deterioro de los alimentos. Además, varios estudios indican su actividad antimicrobiana frente a varios microorganismos. En cambio, su actividad anti-biofilm no ha sido completamente investigada, lo que los hace muy interesantes de explorar. El objetivo de esta tesis fue estudiar la capacidad inhibitoria de diferentes aceites esenciales sobre diferentes etapas de la formación de los biofilms por parte de L. monocytogenes y S. Enteritidis. Para lograr este objetivo general, se establecieron varios objetivos parciales: 1) evaluar la actividad antibacteriana de los cuatro aceites esenciales frente a L.monocytogenes y S. Enteritidis; 2) establecer la concentración mínima inhibitoria (CIM) de cada AE frente a ambos microorganismos; 3) evaluar el efecto de las diferentes dosis (0,5CMI, CMI y 2CMI) sobre la etapa inicial de formación del biofilm; 4) evaluar el efecto de las diferentes dosis (0,5CMI, CMI y 2CMI) sobre la erradicación de los biofilms; 5) realizar el análisis químico de los diferentes AE para caracterizar sus compuestos mayoritarios. Los AE se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) para identificar los principales componentes presentes. La actividad antibacteriana se determinó mediante dos ensayos con el fin de evaluar la sensibilidad de los microorganismos a los AE seleccionados. El primero fue el método de difusión en agar, con el que se midieron los halos de inhibición (HI). El diámetro del HI se relacionó después con la susceptibilidad de la cepa al AE. El segundo experimento fue la determinación de la CMI. Para este ensayo, las bacterias se incubaron durante 18 horas con concentraciones decrecientes del AE. La concentración más baja del AE que inhibió el crecimiento de las bacterias, se consideró como la CMI. Posteriormente se investigó la actividad anti-biofilm. Para empezar, se efectuó el estudio del efecto de los AE sobre la adhesión inicial. Los AE se incubarona 37°C durante 24 horas junto con los cultivos a diferentes dosis (0,5CMI, CMI y 2CMI) en placas de poliestireno de 96 pocillos. Luego, se realizó el ensayo de los mismos AE pero sobre los biofilms previamente formados. Para este ensayo, L. monocytogenes y S. Enteritidis se dejaron crecer previamente para obtener una adherencia, más o menos fuerte. Posteriormente, se añadieron los AE a diferentes dosis (0,5CMI, CMI y 2CMI) a los pocillos y se midió la densidad óptica tras1, 5 y 20 horas de incubación con los aceites esenciales. Finalmente, la biomasa de los biofilms se midió mediante tinción con cristal violeta. Los análisis cromatográficos realizados han mostrado que los tiosulfatos son los principales componentes presentes en los aceites esenciales de ajo y cebolla, mientras que el cinamaldehído fue el componente mayoritario del AE de canela y el eugenol el del AE de clavo. En el método de difusión en agar, el AE de cebolla fue el más inhibidor frente a L. monocytogenes, exhibiendo el HI más alto (37,8 ± 0,4 mm) y el AE de clavo para S. Enteritidis (HI = 12,3 ± 0,4 mm). Para la CMI, en el caso de L. monocytogenes, el AE de canela y el AE de ajo exhibieron el mismo valor (0,1 mg mL−1), mientras que el AE de cebolla y el de clavo tuvieron respectivamente valores de 0,025 y 0,05 mg mL-1. Para S. Enteritidis, el AE de cebolla y el de ajo mostraron el mismo valor: 0,4 mg mL−1. Por otro lado, el AE de canela y el de clavo mostraron un valor de 0,2 y 0,1 mg mL1 respectivamente. La inhibición de la adhesión inicial fue muy alta a una dosis CMI, oscilando entre el 61% y el 100% para L. monocytogenes, mientras que para S. Enteritidis varió del 50% al 65%. Tras una hora de incubación con los AE, la inhibición de los biofilms preformados se encontró entre el 67,7% y el 52,5% para L. monocytogenes, mientras que para S. Enteritidis estaba entre el 40,2% y el 20,3%. Las conclusiones más significativas de esta tesis fueron: 1) el efecto de los aceites esenciales fue mayor sobre L. monocytogenes que sobre S. Enteritidis en todos los casos; 2) el efecto antibiofilm dependió de la dosis; 3) el porcentaje de inhibición fue más alto sobre la adhesión inicial que sobre los biofilms previamente formados. En definitiva, esta investigación ha revelado el potencial de estos aceites esenciales como agentes anti-biofilm, lo cual puede resultar de gran ayuda para la industria alimentaria.

Author

• Somrani, Mariem

• Microbiología
• Tecnología de alimentos
• Listeria monocytogenes
• Salmonella Enteritidis
• Biofilm
• Aceite esencial
• Canela
• Cebolla
• Ajo
• Clavo
• Essential oil
• Cinnamon
• Onion
• Garlic
• Clove

Identifier

hdl:10317/9168

OAI identifier oai:identifier

oai:repositorio.upct.es:10317/9168