Búsqueda de potenciales agentes quimioterápicos para los trastornos del espectro autista (TEA) utilizando Caenorhabditis elegans como modelo de estudio

El sistema nervioso (SN) es el principal centro de coordinación y regulación en los animales, responsable tanto de las funciones voluntarias, como el movimiento y el comportamiento, como de las funciones autónomas, tales como la respiración, la digestión y el control del ritmo cardíaco, además de procesos sofisticados tales como la percepción, la memoria y el aprendizaje. Su desarrollo es un proceso complejo que incluye proliferación celular, diferenciación y sinaptogénesis. Las fallas durante este proceso pueden acarrear consecuencias leves o severas, y pueden conducir a diversos fenotipos neurológicos denominados comúnmente desórdenes del neurodesarrollo (DND). Entre ellos, el Trastorno del Espectro Autista (TEA), es uno de los DND más prevalentes, afectando a más del 2% de la población. Este tipo de trastornos es típicamente de origen multifactorial, entre los que se destacan factores genéticos, epigenéticos y ambientales. Entre la enorme batería de genes cuyas mutaciones aumentan enormemente la probabilidad de desarrollar TEA se encuentra PTEN. Típicamente vinculadas con la aparición de tumores, las mutaciones en PTEN han sido vinculadas cada vez más con la aparición de DND, incluyendo TEA, macrocefalia y otros fenotipos neuropsiquiátricos. A pesar de la enorme evidencia que indica la correlación entre estas mutaciones y el desarrollo del TEA, no se conocen con precisión los mecanismos moleculares por los cuales las fallas en este gen terminan comprometiendo los procesos normales del neurodesarrollo. En lo que respecta a tratamientos para el TEA (y en general para varios DND), no existen abordajes terapéuticos que hayan demostrado altos niveles de eficacia en la mejora de los síntomas centrales como dificultades en la comunicación y patrones de comportamiento repetitivos. Actualmente, las estrategias terapéuticas se enfocan principalmente en intervenciones educativas y conductuales para mejorar la calidad de vida de los pacientes y sus familias, y medicamentos para manejar las comorbilidades. En los últimos años, ha surgido un creciente interés en las dietas cetogénicas (DCs) como una herramienta terapéutica promisoria. Este tipo de regímenes alimentarios, caracterizados por una ingesta baja de carbohidratos, moderada de proteínas y alta de grasas, han sido utilizados con relativo éxito en algunos pacientes con epilepsia refractaria. Existe evidencia, además, que la DC es también capaz de revertir endofenotipos del TEA en humanos y en modelos murinos inducidos por ácido valproico. Al igual que la restricción dietaria, la DC induce un estado de cetosis en la que se producen los metabolitos acetona, acetoacetato y β-Hidroxibutirato (βHB), denominados comúnmente cuerpos cetónicos (CCs). Estos compuestos, además de servir como fuente alternativa de energía a la glucosa, podrían desempeñar un papel crucial en la regulación de procesos celulares alterados en el TEA. Sin embargo, el mecanismo molecular que subyace a los beneficios de la DC y los CCs está aún lejos de ser dilucidado. Resulta evidente entonces, que, para la creación de estrategias terapéuticas eficientes, es imperante avanzar en el conocimiento biológico fundamental que subyace a este tipo de desórdenes. Una de las mayores barreras que históricamente dificultó las disciplinas que abordan el estudio del SN, es la extrema complejidad que este sistema tiene en los mamíferos. En este contexto, el surgimiento de Caenorhabditis elegans como modelo de investigación ha sido fundamental para el avance de diversas disciplinas científicas. La simplicidad de su SN, junto con el rápido ciclo de vida que lo caracteriza y la facilidad para realizar manipulaciones genéticas y ensayos farmacológicos, han permitido lograr avances significativos en los campos de la neurobiología, biología del desarrollo y otras áreas de la biomedicina. Además, su pequeño tamaño y la capacidad de generar un gran número de individuos en poco tiempo facilitan estudios de gran escala, haciéndolo una plataforma versátil y económica para la investigación científica. En la presente tesis, nos propusimos explorar las bases moleculares subyacentes a las disfunciones del neurodesarrollo utilizando C. elegans como modelo. Específicamente, se buscó dilucidar los eventos celulares y moleculares asociados a la mutación del gen daf-18 (homólogo de PTEN en C. elegans) y evaluar las consecuencias funcionales de estas mutaciones. Adicionalmente, abordamos una estrategia farmacológica que busca revertir los fenotipos alterados, basándonos fundamentalmente en los CCs y las investigaciones previas que reportan el potencial de los mismos en el mejoramiento de numerosas funciones biológicas. En la primera sección, nos propusimos estudiar la vía PI3K/AKT/FOXO. Esta vía se encuentra altamente conservada y presenta sus respectivos homólogos en C. elegans, como daf-18 (homólogo de PTEN) y daf-16 (homólogo de FOXO, una importantísima familia de factores de transcripción), entre otros. Como un abordaje inicial, evaluamos los fenómenos asociados a la pérdida de función de este gen, fundamentalmente sobre el desarrollo del SN y sus consecuencias funcionales. Se ha postulado que una característica frecuente en individuos con diversos trastornos neurológicos es la presencia de un desequilibrio entre los sistemas de señalización excitatorios e inhibitorios (E/I), hacia una mayor preponderancia del sistema excitatorio. A diferencia de lo que ocurre en humanos, en C. elegans existe, a nivel de las uniones neuromusculares, tanto señalización GABAérgica inhibitoria como colinérgica excitatoria, lo que permite el uso de este modelo nematode como una plataforma para el estudio del balance E/I. Alteraciones en este equilibrio pueden desencadenar fenotipos de movimiento, así como diferentes sensibilidades a compuestos moduladores de dichos sistemas. En base a ello, y como una primera aproximación, realizamos ensayos con los fármacos estimulantes del sistema colinérgico excitatorio aldicarb y levamisol, los cuales poseen un poder predictivo validado para la evaluación funcional de dichos sistemas. Los resultados de estos ensayos demostraron que mutantes daf-18 y daf-16 presentan una hipersensibilidad a los mismos, sugiriendo un posible desbalance entre los sistemas neuromotores E/I. Adicionalmente, en estos mutantes, encontramos otros fenotipos neuromotores fuertemente vinculados a deficiencias E/I, como un acortamiento excesivo de la longitud corporal luego de la estimulación mecánica en la región anterior, y una menor proporción de giros en omega cerrados durante la respuesta de escape. Más aún, mediante optogenética, observamos que la activación de neuronas GABAérgicas, tanto en animales daf- 18 como daf-16, resultó en un alargamiento del cuerpo de menor magnitud a la observada en animales salvajes. Por otro lado, la estimulación neuronal colinérgica en estos mutantes produjo una contracción exagerada del cuerpo. Al analizar el estado morfológico de las motoneuronas mediante reporteros fluorescentes, pudimos comprobar que tanto mutantes daf-18 como daf- 16 presentan defectos morfológicos en comisuras de neuronas tipo D pertenecientes al sistema GABAérgico, pero no así defectos evidentes en comisuras del sistema colinérgico. Estas aberraciones son visibles ya en el primer estadio larval L1, y son parcialmente rescatadas por la expresión específica de daf-18 en neuronas GABAérgicas. Estos defectos morfológicos en motoneuronas GABAérgicas, presentes desde estadios muy tempranos del desarrollo, sugieren que mutaciones en estos genes podrían estar comprometiendo el neurodesarrollo y consecuentemente ocasionando fenotipos locomotores como los observados. Dado que daf-18 modula negativamente la vía de señalización similar a insulina (es decir, la vía ILPs/AGE-1/AKT, homóloga a la vía insulina/PI3K/AKT en mamíferos), la pérdida de función de daf-18 afecta la actividad del factor de transcripción DAF-16. Nuestros resultados revelaron que todos los fenotipos observados están también presentes en mutantes daf-16 en similar magnitud, tanto en mutantes simples como en dobles. Los fenotipos alterados, no fueron observados, en cambio, en mutantes de genes clave para otras vías íntimamente relacionadas con daf-18¸ como la vía de TOR. Esto es indicativo de que la mayoría de los fenotipos alterados podrían deberse a la disminución de la funcionalidad del factor de transcripción DAF-16, producto de la pérdida de función de daf-18. En la segunda sección nos propusimos abordar el estudio de los efectos de los CCs, específicamente el βHB, por su posible valor terapéutico para el tratamiento de ciertos desórdenes que involucran al SN. Resulta destacable que el βHB, el principal CC bajo DC y restricción dietaria, ha demostrado mejorar numerosos indicadores en C. elegans, como la resistencia al estrés, termotolerancia, longevidad, así como también disminución de agregados proteotóxicos en modelos de Parkinson y Alzheimer. Más interesante aún, es que entre los mecanismos de acción propuestos para los beneficios del βHB se encuentra su potencial para aumentar la actividad de FOXO, y el consecuente aumento de la expresión de numerosos genes citoprotectores. Este escenario resulta promisorio para el uso de este compuesto en aquellos casos en los que FOXO presenta baja actividad por mutaciones que modulan positivamente la vía PI3K/AKT, vía que regula negativamente la actividad de este factor de transcripción. Observamos que la incubación previa con βHB durante todo el desarrollo mejoró el fenotipo de acortamiento excesivo en la respuesta de escape ante un estímulo mecánico, así como también el de hipersensibilidad a los fármacos estimulantes de la actividad colinérgica aldicarb y levamisol en mutantes daf-18. Adicionalmente, pudimos comprobar que el βHB rescata los fenotipos de sobrealargamiento e hipercontracción tras la estimulación optogenética en los sistemas GABAérgico y colinérgico, respectivamente. La exposición a βHB también logró aumentar el porcentaje de giros en omega cerrados durante la respuesta de escape tras la estimulación mecánica en daf-18, y de reducir de manera significativa los defectos morfológicos de las motoneuronas GABAérgica. Dado que ninguna de estas mejoras fueron observadas en mutantes daf-16 o dobles mutantes daf-18;daf-16, nuestros resultados indican que los beneficios obtenidos mediante la exposición a este metabolito podrían explicarse por su capacidad de modular la actividad del factor de transcripción DAF-16. Finalmente, pudimos determinar que existe una etapa crítica para observar los efectos beneficiosos del βHB. Mediante exposiciones en diversas ventanas temporales comprobamos que una breve exposición al βHB durante el desarrollo temprano fue suficiente para revertir varios de estos fenotipos, mientras que exposiciones tardías no mostraron dichos beneficios. En conjunto, los resultados de la presente tesis demuestran el enorme potencial del uso del modelo C. elegans como una plataforma eficiente para el estudio de aquellas mutaciones que comprometen el neurodesarrollo. Los fenotipos descriptos pueden servir como base para la elaboración de flujos de trabajo que apunten a la evaluación de compuestos con potencial terapéutico. Además, los resultados obtenidos constituyen un paso clave hacia la comprensión de los mecanismos de acción de los CCs, fundamentalmente del βHB, y su posible uso en trastornos asociados con mutaciones en genes claves de la vía de PI3K/AKT/FOXO, enormemente implicada en los procesos de neurodesarrollo.

Author dc:creator

• Giunti, Sebastián

Advisor dc:contributor.advisor

• Rayes, Diego Hernán

• Biología
• Trastorno Espectro Autista
• Caenorhabditis elegans
• Dieta cetogénica

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• Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 (CC BY-NC-ND 4.0)

Licence dc:rights.uri

• http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Language dc:language.iso

spa

Dc Identifier Other

2023-1955

OAI identifier oai:identifier

oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/7273