Estudio del papel de CSPa/DNAJC5 en la función y mantenimiento de las sinapsis glutamatérgicas del hipocampo en ratones adultos

La cochaperona sináptica Cysteine String Protein CSP /DNAJC5) se ha implicado en la patogénesis de enfermedades neurodegenerativas como la lipofuscinosis neuronal ceroidea autosómica dominante del adulto (enfermedad de Kufs/CLN4) y las enfermedades de Parkinson y Alzheimer. Se ha demostrado que la proteína CSP /DNAJC5 actúa como cochaperona para mantener la estabilidad de la proteína SNARE SNAP25. Esta cochaperona es esencial para el mantenimiento de sinapsis que operan en un régimen de alta actividad, pero los mecanismos moleculares de su acción protectora no están aún bien establecidos. Por otro lado, el funcionamiento de las sinapsis glutamatérgicas del hipocampo que operan a baja actividad es crucial en los fenómenos de aprendizaje y memoria y en las alteraciones cognitivas asociadas a la neurodegeneración, no obstante, el papel que la CSP /DNAJC5 juega en estas sinapsis es desconocido. En esta tesis doctoral se han empleado ratones knockout (KO) convencionales carentes de CSP /DNAJC5 (ratones Dnajc5 KO) y se han generado y validado nuevos ratones KO condicionales inducibles por tamoxifeno (TMX) carentes de CSP /DNAJC5 (ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ ) y carentes de la proteína SNARE SNAP25 (CaMKII creERT2:Ai27D:Snap25flox/flox) específicamente en neuronas glutamatérgicas del prosencéfalo para el estudio de las sinapsis glutamatérgicas que forman las neuronas hipocampales. En los ratones Dnajc5 KO, la liberación de glutamato evocada por potenciales de acción, la plasticidad a corto plazo, así como la frecuencia de liberación espontánea no presentaron mayores alteraciones en las sinapsis entre las colaterales de Schaffer y las neuronas piramidales de la región CA1 (sinapsis SC CA1). No obstante, la amplitud de las corrientes miniaturas (mEPSCs) resultó estar disminuida, lo que podría deberse a plasticidad homeostática secundaria a un déficit en la transmisión GABAérgica. Curiosamente, en estos ratones, se observó una disminución de los niveles de la proteína SNARE SNAP25 solamente en las sinapsis SC CA1 pero no en las sinapsis formadas entre fibras musgosas de las células granulares y las MF CA3. La investigación de mecanismos autónomo celulares de la cochaperona CSP /DNAJC5 en las sinapsis glutamatérgicas se llevó a cabo en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ que resultaron ser viables, sin presentar fenotipos neurológicos ni conductuales evidentes a edades tempranas, pero que experimentaron un mayor deterioro y mortalidad que los ratones controles a partir de los 12 meses de edad (10 meses post TMX). La liberación de glutamato evocada por potenciales de acción y la plasticidad a corto plazo resultó ser prácticamente normal en las sinapsis SC A1 en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ pero la frecuencia de liberación espontánea y la carga de las corrientes miniaturas (mEPSCs) aparecieron aumentadas. Este fenotipo no se pudo explicar por un cambio estructural en la morfología o en el número de las espinas dendríticas que resultaron ser normales. Curiosamente, se ha descrito un fenotipo similar inducido por la mutación L50S en SNAP25 que causa encefalopatía epiléptica infantil en humanos. Por otro lado, la liberación espontánea de glutamato en las sinapsis MF CA3 resultó ser normal en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ . Análogamente a lo observado en los ratones Dnajc5 KO, en los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ los niveles de la proteína SNARE SNAP25 aparecieron disminuidos en las sinapsis SC CA1 siendo normales en las sinapsis MF CA3. Esto indica que la cochaperona CSP /DNAJC5 es esencial para mantener, mediante un mecanismo postraduccional y autónomo celular, los niveles de SNAP25 en la sinapsis SC CA1 pero no en la sinapsis MF CA3. Las diferencias en la proteostasis de SNAP25 entre las sinapsis SC CA1 y MF CA3 podrían explicar las diferencias en el patrón de liberación espontánea de glutamato entre ambas sinapsis en ausencia de CSP /DNAJC5. Con objeto de investigar el papel de SNAP25 en los fenotipos observados, se estudiaron los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Snap25flox/flox que presentaron un fenotipo de letalidad temprana a las dos semanas de administrar dieta con tamoxifeno. En las sinapsis SC CA1 de los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Snap25flox/flox, la frecuencia de liberación espontánea de glutamato resultó estar disminuida y el tiempo de subida y el decaimiento de las corrientes miniaturas mEPSCs aparecieron enlentecidos. Estos fenotipos podrían deberse a defectos en la formación del complejo SNARE y en la cinética de apertura del poro de fusión. Sorprendentemente, en estas mismas sinapsis la liberación de glutamato evocada por potenciales de acción aumentó. Este fenotipo inesperado podría deberse a la participación compensatoria de otra proteína de la familia de SNAP25 y a una mayor apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje, ya que se ha descrito previamente que SNAP25 bloquea este tipo de canales. En cualquier caso, el fenotipo en la liberación de glutamato observado en las sinapsis SC CA1 de los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ no puede explicarse por una mera disminución en los niveles de SNAP25 en esas sinapsis, pero podría deberse a la existencia de especies de SNAP25 con una conformación mal plegada y aberrante por la falta de la actividad de la cochaperona CSP /DNAJC5, ejerciendo un efecto patológico análogo al observado en la mutación L50S en SNAP25 que causa encefalopatía epiléptica infantil en humanos. Las observaciones realizadas en esta tesis indican que las sinapsis glutamatérgicas del hipocampo son más resilientes a la falta de CSP /DNAJC5 que otras sinapsis centrales como el cáliz de Held o las sinapsis GABAérgicas que expresan parvalbúmina y que operan bajo un régimen de mayor actividad. No obstante, el aumento de la mortalidad a edades avanzadas de los ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ pone de manifiesto un posible papel protector de CSP /DNAJC5 durante el envejecimiento necesario también para el mantenimiento de sinapsis que operan en régimen de baja actividad. Nuestras observaciones abren nuevas perspectivas en los mecanismos por los que las sinapsis mantienen su integridad funcional a lo largo de toda la vida. Por otro lado, hemos observado que las neuronas piramidales de la región CA3 de ratones CaMKII creERT2:Ai27D:Dnajc5flox/ a los 8, 16 y 22 meses después de finalizar la administración de dieta con tamoxifeno, no presentan la lipofuscinosis característica de la lipofuscinosis neuronal ceroidea autosómica dominante del adulto. Esto indica que la falta de función de CSP /DNAJC5 no causa la lipofuscinosis patológica propia de esta enfermedad humana, respondiendo a una pregunta hasta ahora abierta en el campo de la fisiopatología molecular de las lipofuscinosis.

Author dc:creator

• Mesa Cruz, Cristina

Advisors dc:contributor.advisor

• Fernández-Chacón, Rafael
• Nieto González, José Luis

Statement dc:rights

• Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional

Licence dc:rights.uri

• http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Language dc:language.iso

spa

Handle dc:identifier.uri

https://hdl.handle.net/11441/149146

OAI identifier oai:identifier

oai:idus.us.es:11441/149146