Expressão e análise de atividade enzimática da deubiquitinase USP2a recombinante

Resumo: Neste estudo foi realizada a expressão da forma completa e ativa da proteína USP2a e avaliado sua atividade enzimática perante diferentes substratos. A enzima deubiquitinase USP2a está envolvida com diversos processos celulares, e defeitos em sua expressão estão presentes em diversas patologias, como o hepatocarcinoma e câncer de próstata, sendo vista como um possível alvo terapêutico. Entretanto, até o momento, nenhum inibidor seletivo dessa proteína é conhecido. Uma das alternativas para a busca de inibidores está na possibilidade em realizar a varredura de biblioteca de compostos através de ensaios em larga escala, onde diversos compostos podem ser testados simultaneamente. Para a realização desses testes de inibição, torna-se imperativa a obtenção da USP2a purificada e com retenção da sua atividade enzimática. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi a expressão da proteína USP2a recombinante em sistema heterólogo bacteriano e análise de sua atividade. Assim, purificou-se a USP2a e o seu substrato UBA52 após cultura e expressão na cepa BL21(DE3) de E. coli, sendo realizados ensaios de deubiquitinação para testar a atividade da deubiquitinase. Foi visto que a USP2a expressa é enzimaticamente ativa, potencialmente capaz de degradar seu substrato conhecido, o precursor de ubiquitina UBA52. Ademais, ensaios preliminares mostraram a ação dessa enzima em outros dois precursores, UBA80 e HsUBB. Concomitantemente, foi validado o uso da USP2a recombinante no ensaio de clivagem da Ub-Rhod110-G, um substrato fluorescente de deubiquitinases que emite fluorescência quando clivado. Essa metodologia pode ser utilizada em microplacas para a varredura de bibliotecas de compostos. Com a realização desse trabalho, foi possível obter a USP2a recombinante enzimaticamente ativa, bem como a validação de seu uso em um ensaio para varredura em larga escala, possibilitando, a partir dele, a busca de inibidores seletivos da USP2a.

Author dc:creator

• Bueno, Mariane Pagno de Souza

Advisor dc:contributor.advisor

• Zanata, Silvio Marques, 1974-

• Enzimas
• Proteínas
• Bioquímica

Language dc:language

Português

Handle dc:identifier.uri

https://hdl.handle.net/1884/88050

OAI identifier oai:identifier

oai:acervodigital.ufpr.br:1884/88050