Identifizierung und Charakterisierung von IPOD, einem neuen Interaktionspartner der DNA-Methyltransferase Dnmt2 aus Drosophila melanogaster

Die DNA-Methylierung spielt in der epigenetischen Vererbung und in der Entstehung von Krebs eine wichtige Rolle. Vor kurzem wurde gezeigt, dass die DNA-Methylierung in Drosophila Embryonen von Dnmt2 vermittelt wird. Dnmt2-Enzyme besitzen im Gegensatz zu anderen eukaryotischen DNA-Methyltransferasen keine ausgedehnte N-terminale „regulatorische“ Domäne, sondern bestehen vielmehr aus einer kompakten katalytischen Domäne mit hoch konservierten DNA-Methyltransferase-Motiven. Die Mechanismen, die der Regulation und Zielsteuerung dieser Enzyme zu Grunde liegen, sind noch unbekannt. Deshalb wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass Dnmt2 durch Faktoren reguliert sein könnte, welche die fehlende „regulatorische“ Domäne durch Protein-Protein-Interaktionen ersetzen. Da die höchsten Mengen an 5-methyl-Cytosin während der frühen Embryogenese detektiert wurden, erfolgte zur Identifizierung von Dnmt2-interagierenden Proteinen ein Yeast Two-Hybrid Screen mit einer embryonalen Drosophila cDNA-Bibliothek. Als primärer Interaktionspartner von Dnmt2 wurde dabei ein bisher uncharakterisiertes Protein identifiziert, das im Folgenden als „IPOD“ (Interaction Partner Of Dnmt2) bezeichnet wird. Die Interaktion zwischen Dnmt2 und IPOD konnte in Co-Immunopräzipitations-Assays und GST Pull-down Assays bestätigt werden. Dabei gelang der Nachweis, dass die N-terminale Domäne von Dnmt2 für die Wechselwirkung mit IPOD verantwortlich ist. In Übereinstimmung mit der Konservierung von Dnmt2 in Drosophiliden zeigte eine nähere Sequenzanalyse, dass das IPOD-Protein in diesen Spezies hoch konserviert ist. Des Weiteren wies eine Western Blot Analyse mit einem spezifisch gegen IPOD etablierten Antiserum auf eine entwicklungsspezifische Expression von IPOD während der frühen Embryogenese hin. Eine Assoziation von IPOD mit chromosomaler DNA und eine Co-Lokalisierung von Dnmt2 mit IPOD konnte Zellzyklus-abhängig sowohl in Drosophila Embryonen als auch spezifisch in Polytän-Chromosomen aus Speicheldrüsen IPOD-überexprimierender Larven nachgewiesen werden. In Übereinstimmung mit der Co-Lokalisierung beider Proteine in Metaphasen führte die RNAi-vermittelte Reduktion von IPOD in Drosophila Embryonen zu einem Verlust der Assoziation von Dnmt2 an Metaphase-Chromosomen. Darüber hinaus resultierte die Überexpression von IPOD durch ein induzierbares Transgen in Entwicklungsstadien von Drosophila melanogaster, in denen endogen keine DNA-Methylierung nachweisbar ist, in eine Induktion der Dnmt2-Expression und in eine signifikante DNA-Hypermethylierung des Fliegen-Genoms. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die DNA-Methylierung in Drosophila durch die Interaktion von Dnmt2 mit IPOD reguliert wird.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Heidelberg

Year

2005

Author dc:creator

• Kunert, Natascha

Contributors dc:contributor

• Lyko, Frank

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http://www.ub.uni-heidelberg.de/archiv/5968

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