Metallkomplex-funktionalisierte Oligonucleotide und Peptidnucleinsäuren für die DNA-Sequenzerkennung

Die Arbeit umfasst die Synthese Metallkomplex-funktionalisierter Oligonucleotide und Peptidnucleinsäuren und deren Anwendung als Sonden für den sequenzspezifischen DNA-Nachweis. Die Ligation chemisch modifizierter Oligonucleotide (bzw. deren Analoga) am Nucleinsäure-Templat ist ein etabliertes Detektionsverfahren mit hoher Sequenzselektivität, aber geringer Sensitivität aufgrund starker Produkthemmung. Durch Entwicklung einer katalytischen Variante der templatgesteuerten Reaktion konnte die Sensitivität des Verfahrens durch Signalamplifikation gesteigert werden. Dazu wurden terminale Esterkonjugate (Substrate) und Metallkomplexkonjugate (Katalysatoren) von Peptidnucleinsäuren (PNAs) synthetisiert. Die Ester-PNA und die Metallkomplex-PNA wurden am komplementären DNA-Templat in räumliche Nähe gebracht, wodurch die metallkatalysierte Spaltung des Esters stark beschleunigt wurde. Durch den Templateffekt wurde eine Reaktionsbeschleunigung um den Faktor 150 gegenüber der Hintergrundreaktion erzielt. Bei 100fachem Esterkonjugat-Überschuss konnten 35 Umsätze erreicht werden. Eine Fehlbasenpaarung der komplementären DNA erniedrigte die Reaktionsgeschwindigkeit bis zu 15fach. �Molecular Beacons� (Molekulare Leuchtfeuer) sind Oligonucleotid-Sonden mit Haarnadelstruktur, die bei Hybridisierung fluoreszieren, da eine intramolekulare Fluorophor-Quencher-Wechselwirkung unterbunden wird. Im Rahmen der Arbeit wurden �Molecular Beacons� entwickelt, in denen ein Metallkomplex durch koordinative Bindung an den Fluorophor als fluoreszenzlöschende Komponente wirkt. Dazu wurden 3´-Fluorescein und 5´-Ligand modifizierte DNA-Oligonucleotide mit Haarnadelstruktur synthetisiert. Im nicht-hybridisierten Zustand ist die Fluoreszenz der Kupfer(II)-komplexierten Oligonucleotid-Sonden effektiv gelöscht. Durch Hybridisierung mit komplementärer DNA wurde der Metallkomplex vom Farbstoff räumlich getrennt. Dadurch konnte eine 14fache Erhöhung der Fluoreszenz und eine Diskriminierung einer einzelnen Fehlbase um den Faktor 40 erzielt werden. Das Potential dieses neuen Sondentyps liegt in der Möglichkeit, die Stärke der Fluorophor-Quencher-Wechselwirkung abzustimmen, und damit die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren und unspezifische, störende Wechselwirkungen zu blockieren.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Heidelberg

Year

2004

Author dc:creator

• Brunner, Jens

Contributors dc:contributor

• Krämer, Roland

Repository record source_url

http://www.ub.uni-heidelberg.de/archiv/5101

OAI identifier oai:identifier

oai:archiv.ub.uni-heidelberg.de:5101