Identifizierung und Charakterisierung von Histonmethyltransferasen in Drosophila melanogaster

In eukaryotischen Zellen ist die DNA mit Histonen und anderen chromosomalen Proteinen zu Chromatin komplexiert. Das sich wiederholende Grundelement des Chromatins, das Nukleoso-m, besteht aus je zwei Kopien der Histone H2A, H2B, H3 und H4, um die 146 Ba-senpaare DNA gewunden sind. Durch Kondensierung der Nukleosomenreihen bilden sich übergeordnete Chromatinstrukturen, die noch wenig verstanden sind. Zur Ausführung DNA-abhängiger Prozesse muss die Verpackung der DNA teilweise gelockert werden, um zu ge-währleisten, dass die ausführenden Proteine Zugang zu ihren Zielsequenzen haben. Daher existieren verschiedene biochemische Systeme, die die grundlegende Struktur des Chromatins dynamisch kontrollieren. Das Zusammenspiel verschiedener Histonmodifizierungen, wie Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung und Methylierung setzt sowohl synergisti-sche als auch antagonistische Signale, die mit der Häufigkeit, mit der ein Gen transkribiert wird, korrelieren. Dieser „Histoncode“ erzeugt eine Architektur des Chromatins, die von Nichthistonproteinen erkannt wird und dann den Übergang zwischen transkriptionsaktiven und –inaktiven Chromatindomänen bewirken. Untersuchungen in den 1970er und 1980er Jahren zeigten für die Histonmethylierung, die sowohl an Argininen als auch an Lysinen erfolgen kann, eine Beteiligung an der eu- und hete-rochromatischen Transkriptionsregulation. Enzyme, die Histone methylieren können, waren jedoch zu Beginn dieser Arbeit nicht bekannt. Durch die chromatographische Fraktionierung von embryonalem Drosophila-Kernex-trakt konnten hier drei argininspezifische Histonmethyltransferasen identifiziert werden, die den Säugerproteinen CARM1, PRMT1 und PRMT3 homolog sind. Die cDNAs wurden klo-niert und die rekombinanten Proteine biochemisch charakterisiert. Während dieser Arbeit wurden von anderen Gruppen mehrere lysinspezifische Histon-methyltransferasen mit dem katalytisch aktiven Cys-SET(-Domäne)-Cys-Sequenzmotiv in Säugern und Hefe identifiziert. Außerdem wurde eine zentrale Rolle der lysinspezifischen Histonmethylierung in der epigenetischen Genrepression gezeigt. Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurden sieben in Drosophila vorkommende Cys-SET-Cys-Proteine identifiziert und kloniert. Für alle Proteine wurde Histonmethyltransferase-Aktivität mit teilweise unterschiedlicher Substratspezifität gezeigt. Darunter befindet sich auch ASH1 (Absent, Small or Homeotic discs), ein bekannter epigenetischer Aktivator der Trithorax-Gruppe. ASH1 methyliert in Histon H3 Lysin 4 und 9 und in Histon H4 Lysin 20. Die ASH1-abhängige Transkriptionsaktivierung konnte mit der Methylierung der drei Lysin-reste in der Promotorregion von ASH1-Zielgenen korreliert werden. Mittels in vitro Interakti-onsexperimenten und Chromatin-Immunpräzipitationen konnte gezeigt werden, dass durch ASH1-vermittelte Histonmethylierung die Assoziation von Repressoren, wie Polycomb und Heterochromatin-Protein 1 (HP1), verhindert wird. Außerdem konnte eine Korrelation zwi-schen der epigenetischen ASH1-abhängigen Aktivierung der Ultrabithorax-Transkription in Drosophila mit ASH1-vermittelter Histonmethylierung und Rekrutierung oder Stabilisierung der Bindung des aktivierenden Chromatin-Remodelling-Komplexes BRAHMA, dem Dro-sophila SWI/SNF-Homolog, nachgewiesen werden. Die Histonmethyltransferase-Aktivität von ASH1 könnte daher spezifische Signale für die Etablierung epigenetisch aktiver Transkriptionsmuster setzen. Diese Arbeit legt die Grundlagen für die Einbeziehung des Modellsystems Drosophila melanogaster in die Erforschung der Funktionen der Histonmethylierung, für ein besseres Verständnis der epigenetischen Aktivierung und erweitert die Komplexität des „Histoncodes“.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Heidelberg

Year

2003

Author dc:creator

• Beisel, Christian

Contributors dc:contributor

• Paro, Renato

Repository record source_url

http://www.ub.uni-heidelberg.de/archiv/3337

OAI identifier oai:identifier

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