Proteindesign zur Verbesserung des Nucleosidanaloga-Umsatzes in menschlichen Zellen: Desoxycytidin-Kinase und UMP/CMP-Kinase

Die menschlichen Nucleosid- und Nucleosidmonophosphat-Kinasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung einer Vielzahl von Nucleosidanaloga, die in der Behandlung von Virus- und Krebserkrankungen eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurden Enzyme untersucht, die limitierend für die Aktivierung Pyrimidin-basierter Nucleosidanaloga in menschlichen Zellen sein können. Dazu wurden die menschliche Desoxycytidin-Kinase (dCK) und die UMP/CMP-Kinase kloniert, überexprimiert und aufgereinigt. Da neben der Phosphorylierung durch Kinasen auch die Inaktivierung der Nucleosidanaloga durch Desaminasen eine wichtige Rolle spielt, wurden die menschliche Cytidin- und die Desoxycytidylat-Desaminase ebenfalls rekombinant hergestellt und in die Untersuchungen einbezogen.In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Arnon Lavie wurde die Kristallstruktur der menschlichen dCK und der UMP/CMP-Kinase gelöst. Für die dCK konnten dabei Strukturen in Komplex mit dCyt und den zwei wichtigen Nucleosidanaloga AraC und Gemcitabin erhalten werden. Daraus ließen sich wichtige Informationen über die Bindung und Phosphorylierung dieser Substrate ableiten. Die UMP/CMP-Kinase konnte in der Substrat-freien Konformation kristallisiert werden. Dies erlaubte die Rekonstruktion des Katalysemechanismus durch Vergleich mit Kristallstrukturen anderer Spezies, die in anderen, Substrat-gebundenen Konformationen vorliegen. Die Untersuchungen der menschlichen Desaminasen CDA und dCMP-DA ergaben, daß beide Enzyme in der Lage sind, wichtige Nucleosidanaloga zu desaminieren. Der Vergleich der Aktivitäten beider Desaminasen zeigt, daß der größte Beitrag zur Inaktivierung der Nucleosidanaloga in den Zellen wahrscheinlich von der menschlichen CDA ausgeht.Hauptziel dieser Arbeit war es, diese Nucleosid-Kinasen kinetisch und an Hand der Proteinstruktur zu untersuchen, um Informationen für das Design von Mutanten mit verbesserter Kinaseaktivität für Nucleosidanaloga zu erhalten.Auf der Basis von Sequenzvergleichen wurden Deletionsmutanten der dCK erstellt, bei denen eine Region, die in der Kristallstruktur einen Loop bildet, teilweise entfernt wurde. Bei der dCK?2-Mutante konnte dadurch, bei fast unveränderter Aktivität für die dCyt-Phosphorylierung, eine Verschiebung der Spezifität von Purin- zu Pyrimidin-Substraten erreicht werden. Eine Verbesserung der Kinaseaktivität gelang mit diesen Mutanten allerdings nicht.Auf der Basis von Struktur- und Sequenzvergleichen mit der Dm-dNK konnten katalytisch wichtige Aminosäuren identifiziert werden, die zur Entwicklung der dCK-Dreifachmutante führten. Mit dieser Mutante konnte eine deutliche Steigerung der Enzymaktivität der menschlichen dCK erreicht werden. Erstaunlich ist die Steigerung der Phosphorylierungseffizienz des Enzyms um den Faktor 41 für das natürliche Substrat dCyt. Auch für die in dieser Arbeit wichtigen Nucleosidanaloga konnte die Enzymaktivität verbessert werden. Für die Nucleosidanaloga AraC, Gemcitabin und 5-Aza-dCyt stiegen die kcat-Werte um Faktoren zwischen 3 und 14. Darüber hinaus konnte eine neue Enzymaktivität festgestellt werden. Die Dreifachmutante ist, im Gegensatz zum Wildtyp-Enzym, in der Lage, auch Thd effizient zu phosphorylieren. Gleichzeitig verringerte sich die Enzymaktivität für die Purin-Substrate dGuo und dAde. Insgesamt findet bei der Dreifachmutante eine Verschiebung der Substratspezifität zu den Pyrimidin-Substraten bei gleichzeitiger Erhöhung der Aktivität statt.Um die Relevanz dieser Aktivitätssteigerungen im Hinblick auf die Aktivierung von Nucleosidanaloga zu zeigen, wurden Experimente an menschlichen Zellen durchgeführt. Dabei konnten erfolgreich zwei Methoden zur Proteintransduktion getestet werden. Die Pep-1-vermittelte Proteintransduktion scheint dabei Vorteile gegenüber der Methode mit PTD-Fusionsproteinen zu haben. Die eingebrachten Proteine haben die AraC-Aktivierung in den Zellen positiv beeinflußt. Der Vergleich des Wildtyp-Enzyms und der Dreifachmutante zeigt, daß bei der Mutante bei niedrigerer AraC- und Proteinkonzentration ein effektiveres Abtöten der Zellen erreicht werden kann. Diese Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit, die dCK-Dreifachmutante im Rahmen von proteintherapeutischen Versuchen zur Modulation des Nucleosidanalogon-Umsatzes in Krebszellen einzusetzen.

Author dc:creator

• Ort, Stephan

Contributors dc:contributor

• Gallwitz, Dieter Prof. Dr.
• Irniger, Stefan PD Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Nucleosidkinasen
• Deoxycytidin-Kinase
• UMP/CMP-Kinase
• Cytidin-Deaminase
• Deoxycytidylat-Kinase
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• Proteindesign
• Nucleoside kinase
• deoxycytidine kinase
• UMP/CMP kinase
• cytidine deaminase
• deoxycytidylate deaminase
• nucleoside analogs
• gemcitabine
• crystal structure
• protein design
• 42.13
• WF

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

ger

Identifier

urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-23-6
webdoc-23
501606610

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