Analysen zu TRIM-Genen in Primaten

Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Evolution von TRIM-Genen mit identischer Domänenstruktur wie das antivirale TRIM5a (RBCC-B30.2) untersucht. Die analysierten TRIM-Gene lokalisieren innerhalb zweier Gencluster auf Chromosom 6 und Chromosom 11 (MHC- und 11p15-Cluster). Diejenigen TRIM-Gene, die innerhalb eines Clusters auf einem Chromosom lokalisieren, sind auch phylogenetisch eng miteinander verwandt, so dass auf Genduplikation von TRIM-Genen auf Chromosom 6 und 11 geschlossen werden kann. Vergleiche der Vollängensequenzen der TRIM-Gene des MHC- und 11p15-Clusters zwischen Mensch und Rhesusaffe zeigten, dass die TRIM-Gene des MHC-Clusters stark konserviert sind und nur wenige synonyme und nichtsynonyme Substitutionen aufweisen, während innerhalb des 11p15-Clusters TRIM21 und TRIM22 neben TRIM5a Anzeichen von positiver Selekion aufweisen. Insbesondere bei getrennten Analysen von Tripartite Motif und B30.2-Domäne konnte festgestellt werden, dass bei TRIM21 das Tripartite Motif leichte Anzeichen einer positiven Selektion aufweist, während die B30.2-Domäne negativ selektioniert ist. TRIM22 dagegen weist innerhalb des Tripartite Motif eine negative Selektion auf und ist innerhalb der B30.2-Domäne positiv selektioniert, vergleichbar mit der B30.2-Domäne von TRIM5a. Somit konnte mit TRIM22 ein geeignetes Kandidatengen für funktionelle Analysen identifiziert werden. Für die funktionellen Analysen wurde zunächst der gesamte offene Leserahmen verschiedener TRIM-Proteine in den pAcGFP1-N1-Vektor kloniert, um das daraus resultierende TRIM-GFP-Fusionsprotein hinsichtlich der subzellulären Lokalisation untersuchen zu können. Es zeigte sich, dass TRIM-Proteine unterschiedliche subzelluläre Kompartimente identifizieren. TRIM10 ist diffus im Zytoplasma lokalisiert, TRIM26, TRIM27 und TRIM39 weisen unterschiedliche punktuelle Proteinanhäufungen auf und TRIM21 zeigt fadenförmige Strukturen, die mit den Mikrotubuli assoziieren. Untersuchungen der subzellulären Lokalisation des humanen TRIM22 (hTRIM22) und TRIM22 des Rhesusaffen (rhTRIM22) zeigten, dass beide Proteine unterschiedliche Lokalisationen aufweisen: hTRIM22 ist diffus im Zytoplasma verteilt, während rhTRIM22 punktförmige Proteinanhäufungen nahe des Zellkernes aufweist. Diese Lokalisationen konnten in verschiedenen Zelllinien und mit verschiedenen Anhängen (GFP, V5/His) beobachtet werden. Die punktförmigen Proteinanhäufungen von rhTRIM22 sind hohle Strukturen, die je nach Dauer der Expression in Größe zunehmen und in Anzahl abnehmen. Vergleiche mit der subzellulären Lokalisation des antiviralen TRIM5a zeigten, dass hTRIM5a mit rhTRIM22 vergleichbare Proteinanhäufungen zeigt, während die subzelluläre Lokalisation von rhTRIM5a vergleichbar mit der von hTRIM22 ist. Mit Hilfe von chimärischen Konstrukten, bei denen die B30.2-Domäne von TRIM22 zwischen Mensch und Rhesusaffe ausgetauscht wurde, konnte nachgewiesen werden, dass die B30.2-Domäne für die unterschiedliche subzelluläre Lokalisation verantwortlich ist. Durch verschiedene weitere chimärische Konstrukte, bei denen Aminosäuren mit Hilfe von Restriktionsschnittstellen oder mittels gerichteter Mutagenese ausgetauscht wurden, konnten die Bereiche, die für die Lokalisation verantwortlich sind, näher bestimmt werden. Es zeigte sich, dass die dafür verantwortlichen Aminosäuren innerhalb variabler Loops lokalisieren, die vermutlich miteinander in Wechselwirkung treten können. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit ein anti-TRIM22-Antikörper etabliert. Mit Hilfe des polyklonalen anti-TRIM22-Antikörpers konnte bereits die Lokalisation des nativen TRIM22 in HeLa- und COS-7-Zellen visualisiert werden. Das native Protein lokalisiert innerhalb des Zytoplasmas und ist mit dem Mikrotubuli-Netzwerk assoziiert. Eine Überexpression von hTRIM22 führt zu einer Anhäufung des Proteins an den Zentrosomen und zerstört diese. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von hTRIM22 nach etwa 30 h zu Apoptose führt.

Author dc:creator

• Herr, Anna-Maria

Contributors dc:contributor

• Hoyer-Fender, Sigrid Prof. Dr.
• Fritz, Hans-Joachim Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Tripartite Motif
• Evolution
• Primaten
• TRIM22
• Subzelluläre Lokalisation
• Apoptose
• primates
• subcellular localisation
• apoptosis
• 42.13 Molekularbiologie
• 42.20 Genetik
• 42.21 Evolution
• WF 000: Molekularbiologie, Gentechnologie
• WH 000: Cytologie {Biologie}
• WJ 000: Genetik {Biologie}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-334
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2088-3
webdoc-2088
606108491

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AD57-8