Untersuchungen zu bioabbaubaren Genvektoren und in situ gebildeten Filmen als neue Arzneiformen für die Applikation von Gentherapeutika

Die Gentherapie birgt vielversprechendes Potential als Kausaltherapie für die Behandlung zahlreicher vererbter und erworbener Krankheiten. Nukleinsäuren als neue Arzneistoffe sind sehr vielfältig einsetzbar, setzten allerdings einen erfolgreichen Transport zum Wirkort voraus. Lange Zeit dominierten virale Systeme klinische Studien auf dem Gebiet der Gentherapie, da diese zu hohen Genexpressionsraten führten. Schwerwiegende Nebenwirkungen bewirkten allerdings einen leichten Rückgang zugunsten nicht-viraler Systeme in den letzten Jahren. Die größte Herausforderung für eine erfolgreiche therapeutische Anwendung bleibt daher der effiziente Transfer an den Zielort bei gleichzeitig guter Verträglichkeit und kontrollierten Expressionsraten. Gegenstand des ersten Teils dieser Arbeit war die Entwicklung eines neuartigen polymeren Trägersystems für den nicht-viralen Gentransfer mit dem Fokus auf die Lunge. Untersucht wurden bioabbaubare chimäre Polymer-Polypeptid Konjugate auf Methacrylat-Basis im Vergleich zu herkömmlichen Trägersystemen wie dem verzweigten Polyethylenimin (brPEI) 25kDa. Oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylat (OEGMA) verschiedener Kettenlängen and N,N-dimethylaminoethyl methacrylat (DMAEMA) wurden mittels ATPR zu definierten P(DMAEMA-co-OEGMA) Copolymeren mit konstantem Polymerisierungsgrad, aber unterschiedlichem PEGylierungsgrad (OEGMA-Anteil und Oligomerisierungsgrad des OEGMA-Monomers) polymerisiert. Die biophysikalische Charakterisierung der Polyplexe ergab, dass Partikelgröße, Bindungsstärke, Morphologie und Zetapotential der Partikel durch den PEGylierungsgrad variiert werden konnte, so dass eine maßgeschneiderte Anpassung des Trägersystems an den eingesetzten Nukleinsäuretyp und an die gewünschten Partikelcharakteristika ermöglicht wurde. Eine ausreichende sterische Stabilität der Polyplexe bei hoher Plasmid- DNA Konzentration in isotonischer Kochsalzlösung und eine geringe Zytotoxizität der Polyplexe konnte bereits durch geringen PEGylierunsgrad erzielt werden. Die Einführung ungeladener hydrophiler OEG-Segmente führte zur Abschirmung der positiven Oberflächenladung unabhängig von der verwendeten Nukleinsäure. Zetapotentialmessungen deuteten auf eine "Core-Shell- Corona''-ähnliche Partikelstruktur hin, die im Wässrigen durch eine hydrophile PEG Schale stabilisiert wurde. Transfektionsstudien mit Plasmid-DNA zeigten eine Reduktion des Gentransfers durch Einführung von OEG-Einheiten auf Lungenzelllinien, wobei die Transfektionseffizienz optimierter P(DMAEMA-co- OEGMA) Copolymere vergleichbare Werte zu P(DMAEMA) und um den Faktor 10 geringer als brPEI lieferten. Gründe hierfür waren i) eine ungenügenden Komplexierung, ii) eine moderate Zellbindung sowie iii) eine unzureichende endosomale Freisetzung. Überraschenderweise zeigte sich augrund verbesserte Komplexierung zu nanoskaligen Polyplexen eine Steigerung der Gentransfereffizienz von mRNA mit P(DMAEMA-co-OEGMA) Copolymeren im Vergleich zu P(DMAEMA). Ferner wurde durch Veränderungen im Polymerdesign eine 6-fache Erhöhung der Gentransfereffizienz in vitro bewirkt. Kombiniert mit funktionellen Peptide, wie dem endosomolytisch aktiven INF7-Peptid oder dem zellpenetrierenden TAT-Dimer, war eine Steigerung bis um den Faktor 100 möglich. Unter Einsatz von Copolymeren mit optimierten PEGylierungsgrad konnte nach intratrachealer Applikation eine 7-fach gesteigerte Genexpression im Vergleich zu br-PEI 25kDa in der Lunge gemessen werden. Nicht zuletzt aufgrund der guten kolloidalen Stabilität und der guten Biokompatibilität stellen P (DMAEMA-co-OEGMA) Copolymere daher eine vielversprechende Alternative zu herkömmlichen Trägersystemen im nicht-viralen Gentransfer dar. Erfolgversprechend erscheinen auch die Ansätze in Kombination mit mRNA, die im Gegensatz zur pDNA bereits im Zytoplasma wirksam ist und für die bis heute keine effektiven Transfersysteme bekannt sind. Im weiteren Teil der Arbeit wurde ein Film zur kontrollierten Freisetzung nicht-viraler Genvektoren entwickelt. In situ geformte Implantate wurden bereits als Alternative zu ex vivo hergestellten Matrices für Proteine untersucht. Im Bereich des Gentransfers ist allerdings wenig bekannt. Für Herstellung der Filme wurde ein Applikationssystem der Firma Baxter eingesetzt, das aus einer 10%igen (m/v) PLGA-Lösung in einem biokompatiblen, wassermischbaren Lösungsmittel gelöst (lipophilen Komponente) und Wasser für Injektionszwecke (hydrophilen Komponente) bestand. Die mechanische Festigkeit der Filme und der Einbau der Polymere in die Matrix wurden durch die Wahl des Lösungsmittels und des Polymers bestimmt, so dass besonders hochmolekulare Polymere mit veresterten Endgruppen in Kombination mit einer guten Wassermischbarkeit des verwendeten Lösungsmittels zu einer guten Filmbildung führten. Als Matrixbildner wurden PLGA Polymere unterschiedlicher Kettenlänge und Zusammensetzung getestet, um die die Freisetzungskinetik der Polyplexe zu kontrollieren. Lyophilisierte pDNA/l-PEI Polyplexe als Modellwirkstoff konnten erfolgreich in den gebildeten Film eingebaut werden, indem die Polyplexe zuvor in der hydrophilen Phase gelöst oder in der lipophilen Phase dispergiert wurden. Freisetzungsstudien zeigten, dass der Einbau der Polyplexe in die Filme und deren Freisetzungskinetik durch die Wahl des Lösungsmittels, des Molekulargewichts des Polymers sowie der Einbettungsvariante gesteuert werden konnten. In situ geformte Filme sind in der Lage, lyophilisierte Polyplexe über einen Zeitraum von 4 Wochen freizusetzen, und können darüber hinaus als physikalische Barriere fungieren. Daher schienen diese Filme zur Verhinderung peritonealer Verwachsungen nach Operationen im Bauchraum geeignet, bei denen es innerhalb 2-3 Wochen nach dem Eingriff zur Bildung fibröse Strukturen kommt. Diese sind vor allem ein krankhaftes Ungleichgewicht zwischen dem gewebespezifischen Plasminogenaktivator (tPA) und dessen Inhibitior (PAI-1) zurückzuführen. Der Einbau einer für tPA kodierenden Plasmid-DNA (ptPA) in den Sprühfilm führte zu einem tPA-Spiegel von 2 ng/ml über einen Zeitraum von 16 Tagen in vitro. Ferner konnte durch Kotransfektion der Plasmid-DNA mit einer siRNA gegen PAI-1 ohne Einbau in den Film eine 8,3 fache Steigerung des tPA/PAI-Verhältnisses 48 h nach der Transfektion erzielt werden. Diese Steigerung korreliert gut mit dem Abfall des Verhältnisses im entzündeten Gewebe. Die Kombination beider Ansätze und deren therapeutische Relevanz hängen von den weiteren in vitro und in vivo Ergebnissen ab und bleiben daher abzuwarten. Nichtsdestotrotz stellen in situ geformte Filme, aufgebaut aus bioabbaubaren und gewebeverträglichen Polymeren, eine attraktive Alternative zu herkömmlichen Trägersystemen für den Gentransfer dar, um kurze Expressionszeiten und Nebenwirkungen aufgrund zu hoher Nukleinsäurespiegel zu verhindern.

Author dc:creator

• Üzgün, Senta

• gene therapy
• nonviral
• gene transfer
• sustained release
• polymers

Licence dc:rights.uri

• http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen

Language dc:language

ger

Identifier URI

http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14312

OAI record oai:identifier

https://refubium.fu-berlin.de/oai/request?verb=GetRecord&metadataPrefix=dim&identifier=oai%3Arefubium.fu-berlin.de%3Afub188%2F10114