Aufklärung des enzymatischen Mechanismus der L-Fuculose-1-phosphat-Aldolase aus Escherichia Coli durch ortsgerichtete Mutagenese und röntgenographische Untersuchungen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der enzymatische Mechanismus sowie die Kontrolle der Diastereoselektivität der L-Fuculose-1-phosphat-Aldolase aus E. coli durch Mutagenese-Studien untersucht. Grundlage bei der Planung der entsprechenden Mutanten waren die bis zu atomarer Auflösung bestimmten Röntgenstrukturen des Wildtyps in unligierter Form sowie im Komplex mit dem Übergangszustandsanalogon Phosphoglycolohydroxamat. Diese hatten gezeigt, daß die vier aktiven Zentren in dem tetrameren Enzym an den Grenzflächen zwischen je zwei Untereinheiten liegen und jeweils Reste beider Untereinheiten an ihrem Aufbau beteiligt sind. <br>Mittels der Röntgenstrukturen und der kinetischen Daten der erzeugten Mutanten konnte ein so detailliertes Verständnis der FucA-katalysierten Reaktion erlangt werden, daß gute Modelle für das Binden von L-Lactaldehyd bzw. L-Fuculose-1-phosphat im aktiven Zentrum aufgestellt werden konnten. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß das C-terminale Kettenende aus den Resten 207 bis 215 an der Katalyse partizipiert und nach erfolgter Substratbindung das aktive Zentrum durch einen induced fit verschließt. In der Struktur des WT hatten diese Reste keine definierte Konformation. Durch die kinetischen Daten der C-terminalen Mutanten konnte jedoch nachgewiesen werden, daß die Reste Tyr209' und Glu214' höchstwahrscheinlich mit dem Substrat interagieren. Als katalytisch kompetente Reste wurden Glu73, Tyr113 und Tyr209 identifiziert. <br>Neben der Rolle des C-terminalen Kettenendes sowie einzelner Reste, konnte auch die Bedeutung eines hydrophoben Bereichs im aktiven Zentrum aufgeklärt werden. So konnte durch Mutationen in diesem Bereich die Diastereoselektivität des Enzyms für ausgewählte Aldehyde gezielt manipuliert werden. <br>Die Analyse der strukturellen Umordnungen in Mutante S71Q zeigte auf deutliche Weise, daß das aktive Zentrum von FucA keinesfalls als starres Polypeptid-Gerüst angesehen werden darf, wie es die Kristallstrukturen des Wildtyps suggerieren könnten

Author dc:creator

• Jörger, Andreas C.

Contributors dc:contributor

• Schulz, Georg E.

• biocatalysts
• L-fuculose 1-phosphate aldolase
• catalytic mechanism
• site-directed mutagenesis
• X-ray crystallography

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