In vitro Analysen der Interaktion von Chaperonen mit naszierenden Polypeptidketten

In Escherichia coli sind der ribosomenassoziierte Trigger Faktor (TF) und das Hsp70-Chaperon DnaK an der Faltung neusynthetisierter Proteine beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde die kotranslationale Interaktion von TF und DnaK mit naszierenden Polypeptidketten untersucht. Dazu wurde ein zellfreies Transkription-Translationssystem auf der Basis von E.coli-Zellextrakten etabliert, das Ribosomen, TF und DnaK in physiologischem Verhältnis enthielt. In diesem System konnte erstmals die direkte Interaktion von DnaK mit naszierenden Polypeptidketten über Quervernetzung gezeigt werden. Die DnaK-Assoziation mit der Polypeptidkette erfolgte dabei über die Substratbindetasche, somit stellt die Quervernetzungsreaktion eine spezifische Substrat-Chaperon-Interaktion dar. <br>Ferner wurde die Bindung von TF und DnaK an das Modellprotein sigma32 in unterschiedlichen Faltungstadien analysiert: ribosomenassoziierte naszierende Peptidketten und Vollängen-Protein, welches vom Ribosom freigesetzt in die native Struktur falten konnte und in diesem Zustand ein DnaK-Substrat darstellt. TF und DnaK konnten mit naszierenden sigma32-Polypeptidketten quervernetzt werden. Natives sigma32 wird jedoch nur von DnaK gebunden. Beide Chaperone überschneiden sich also in der Fähigkeit, mit naszierenden Polypeptidketten zu interagieren. Die Analyse der funktionellen Beziehung zwischen TF und DnaK bei der Bindung an die naszierende Kette zeigte, dass TF bei zellulärem Chaperonverhältnis mit höherer Affinität bevorzugt bindet. Beide Chaperone kompetitieren aber um die Bindung an die Polypeptidkette, was auf gemeinsame Bindestellen in diesen Substraten zurückgeführt werden könnte. Dies erklärt auch die Beobachtung, daß DnaK TF zumindest teilweise bei der de novo Proteinfaltung funktionell ersetzen kann. Die TF-Funktion ist also auf Substrate am Ribosom während der Translation beschränkt, während DnaK ein breites funktionelles Spektrum aufweist.

Author dc:creator

• Schaffitzel, Elke

Contributors dc:contributor

• Bukau, Bernd

• DnaK
• Trigger Faktor
• Hsp70
• protein synthesis
• protein folding
• trigger factor

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