Qualitative und quantitativ-kompetitive in vivo Longitudinalanalyse retroviral transduzierter CD34+ Zellen im Pavianmodell

Retrovirale Vektoren können infolge ihrer stabilen und näherungsweise zufällig in das zelluläre Genom verteilten Integration als Klonalitätsmarker verwendet werden. Jede transduzierte Zelle und ihre Nachkommen werden durch ihre individuelle viral-genomische Fusionssequenz charakterisiert. Gelingt ein molekularer Nachweis dieser spezifischen Integrationsflanken in Zellen des peripheren Blutes, können eine mögliche Selbsterneuerungsfähigkeit, eine Langzeitaktivität sowie eine Pluripotenz von transplantierten transduzierten Zellen untersucht werden. <br>Es wurde eine PCR-Methode zum hoch sensitiven und spezifischen Nachweis proviraler Integrationsflanken etabliert. Voraussetzung für die Entwicklung dieser Methode war die Identifikation und Sequenzierung der Integrationsflanken. Die Arbeit wurde auf ein Pavian-Modell mit hoher, bis zu 10 iger Transduktionseffizienz angewendet. <br>Die Durchführung der in vivo Longitudinalanalyse erfolgte an peripheren Blutleukozyten (PBL), an Granulozyten (CD 13+), an B-Lymphozyten (CD 20+) sowie an verschiedenen T-Lymphozyten-Populationen (CD 3+,CD 4+, CD 8+), die zwischen 2 und 33 Monaten nach Transplantation retroviral transduzierter hämatopoetischer Vorläuferzellen isoliert wurden. Insgesamt konnte an drei Klonen eine Langzeitaktivität über den gesamten Zeitraum gezeigt werden. An zwei untersuchten Klonen wurde eine Pluripotenz durch Identifikation spezifischer PCR-Produkte in myeloiden und lymphoiden Zellfraktionen nachgewiesen. Diese beiden Klone wurden durch Einführung eines internen Standards auch quantitativ beobachtet. Der Anteil eines Klones an der Gesamthämatopoese schwankte über den Beobachtungszeitraum zwischen 0,3-10 und nahm im weiteren Verlauf relativ gesehen zu. <br>Die Ergebnisse liefern den molekularen Beweis für die Langzeitaktivität und Pluripotenz von repopulierenden Vorläuferzellen im Großtiermodell. Diese Kenntnisse sind Voraussetzung für eine erfolgreiche Gentherapie des blutbildenden Systems.

Author dc:creator

• Haas, Sebastian

Contributors dc:contributor

• Mertelsmann, Roland

• retroviral

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