Untersuchung von PRV-1 auf Protein-Protein-Interaktions-partner im Yeast-Two-Hybrid Assay und weitere Aufklärung der 5'cDNA-Sequenz einer potentiellen Tyrosinkinase

Auf der Suche nach der molekularbiologischen Ursache der Erkrankung "Polycythaemia vera" wurden mehrere Kandidatengene in einem Screening-Verfahren (Subtraktive Hybridisierung) gefunden. In dieser Arbeit wurden zwei dieser Kandidatengene, PRV-1 (Projekt I) und AB3 (Projekt II), näher untersucht. <br>Um Aussagen über die Funktion von PRV-1 treffen zu können, sollten mittels eines Verfahrens zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen potentielle Bindungspartner von PRV-1 aufgespürt werden. Aufgrund der verhältnismäßig physiologischen Bedingungen wurde hierzu eine Yeast-two-hybrid-Screen verwendet. Dabei wurde PRV-1 ohne die natürliche Leadersequenz in-frame in den Bait-Vektor pGBKT7 kloniert. Anschließend wurde das Bait-Konstrukt in den Hefestamm Sacharomyces cerevisiae AH109 transformiert. Die korrekte Protein-Expression von PRV-1 in S. cerevisiae wurde durch Western Blots mit Antikörpern gegen PRV-1 und das im Bait-Vektor kodierte c-myc Tag überprüft. Nach Phänotypentestung des bait-tragenden Hefestammes wurde das Screening einer "Pretransformed cDNA Human Bone Marrow Library" durch Mating durchgeführt. Insgesamt wurden dabei 307, auf Quadrupel Dropout Medium wachstumsfähige, Kolonien gefunden. Aus drei exemplarischen Kolonien wurden dann die Prey-Plasmide in einem zweischrittigen Prozess aufgereinigt und die funktionelle Prey-Bait-Interaktion ihres Proteinproduktes nach Retransfomation bestätigt. Nach Sequenzierung konnten die Prey-Plasmide schließlich durch Datenbankabgleich, soweit bekannt, identifiziert werden. <br>Um mehr über das Gen AB3 heraus zu finden, sollte mittels einer 5' RACE mehr Sequenzinformation von AB3 aufgeklärt werden. Durch einen, mit einer 32P-gelabelten AB3-Sonde hybridisierten, Northern Territory RNA Blot gelang es, Lungengewebe als ein Gewebe zu identifizieren, in dem AB3 deutlich exprimiert wird. In vier Runden 5-RACE mit der "Marathon Ready cDNA Library: Human Lung" gelang es insgesamt 4230bp neue 5'cDNA-Sequenz aufzuklären und die bekannte AB3 cDNA-Sequenz damit von 3441bp auf 7671bp zu verlängern. Durch Datenbankvergleiche mit anderen Genen konnten zwei Domänen postuliert werden. Zusammenfassend handelt es sich bei AB3 wahrscheinlich um eine Tyrosinkinase mit C-terminaler katalytischer Tyrosinkinasedomäne und etwas N-terminalerer leucin-rich repeat Domäne. Da innerhalb der bekannten Sequenz keine Transmembran-Domäne gefunden wurde, könnte AB3 somit als intrazelluläre Tyrosinkinase an der Signaltransduktion beteiligt sein.

Author dc:creator

• Buchkremer, Stefan

Contributors dc:contributor

• Pahl, Heike-L.

• RACE
• myeloproliferative syndrome
• Yeast-Two-Hybrid-System
• Cancer research
• Non receptor tyrosine kinase, protein-tyrosine-kinase, RACE

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