{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:2500"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:2500","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Untersuchung von PRV-1 auf Protein-Protein-Interaktions-partner im Yeast-Two-Hybrid Assay und weitere Aufklärung der 5'cDNA-Sequenz einer potentiellen Tyrosinkinase","abstract":"Auf der Suche nach der molekularbiologischen Ursache der Erkrankung \"Polycythaemia vera\" wurden mehrere Kandidatengene in einem Screening-Verfahren (Subtraktive Hybridisierung) gefunden. In dieser Arbeit wurden zwei dieser Kandidatengene, PRV-1 (Projekt I) und AB3 (Projekt II), näher untersucht.
Um Aussagen über die Funktion von PRV-1 treffen zu können, sollten mittels eines Verfahrens zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen potentielle Bindungspartner von PRV-1 aufgespürt werden. Aufgrund der verhältnismäßig physiologischen Bedingungen wurde hierzu eine Yeast-two-hybrid-Screen verwendet. Dabei wurde PRV-1 ohne die natürliche Leadersequenz in-frame in den Bait-Vektor pGBKT7 kloniert. Anschließend wurde das Bait-Konstrukt in den Hefestamm Sacharomyces cerevisiae AH109 transformiert. Die korrekte Protein-Expression von PRV-1 in S. cerevisiae wurde durch Western Blots mit Antikörpern gegen PRV-1 und das im Bait-Vektor kodierte c-myc Tag überprüft. Nach Phänotypentestung des bait-tragenden Hefestammes wurde das Screening einer \"Pretransformed cDNA Human Bone Marrow Library\" durch Mating durchgeführt. Insgesamt wurden dabei 307, auf Quadrupel Dropout Medium wachstumsfähige, Kolonien gefunden. Aus drei exemplarischen Kolonien wurden dann die Prey-Plasmide in einem zweischrittigen Prozess aufgereinigt und die funktionelle Prey-Bait-Interaktion ihres Proteinproduktes nach Retransfomation bestätigt. Nach Sequenzierung konnten die Prey-Plasmide schließlich durch Datenbankabgleich, soweit bekannt, identifiziert werden.
Um mehr über das Gen AB3 heraus zu finden, sollte mittels einer 5' RACE mehr Sequenzinformation von AB3 aufgeklärt werden. Durch einen, mit einer 32P-gelabelten AB3-Sonde hybridisierten, Northern Territory RNA Blot gelang es, Lungengewebe als ein Gewebe zu identifizieren, in dem AB3 deutlich exprimiert wird. In vier Runden 5-RACE mit der \"Marathon Ready cDNA Library: Human Lung\" gelang es insgesamt 4230bp neue 5'cDNA-Sequenz aufzuklären und die bekannte AB3 cDNA-Sequenz damit von 3441bp auf 7671bp zu verlängern. Durch Datenbankvergleiche mit anderen Genen konnten zwei Domänen postuliert werden. Zusammenfassend handelt es sich bei AB3 wahrscheinlich um eine Tyrosinkinase mit C-terminaler katalytischer Tyrosinkinasedomäne und etwas N-terminalerer leucin-rich repeat Domäne. Da innerhalb der bekannten Sequenz keine Transmembran-Domäne gefunden wurde, könnte AB3 somit als intrazelluläre Tyrosinkinase an der Signaltransduktion beteiligt sein.","abstract_html":"Auf der Suche nach der molekularbiologischen Ursache der Erkrankung "Polycythaemia vera" wurden mehrere Kandidatengene in einem Screening-Verfahren (Subtraktive Hybridisierung) gefunden. In dieser Arbeit wurden zwei dieser Kandidatengene, PRV-1 (Projekt I) und AB3 (Projekt II), näher untersucht. <br>Um Aussagen über die Funktion von PRV-1 treffen zu können, sollten mittels eines Verfahrens zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen potentielle Bindungspartner von PRV-1 aufgespürt werden. Aufgrund der verhältnismäßig physiologischen Bedingungen wurde hierzu eine Yeast-two-hybrid-Screen verwendet. Dabei wurde PRV-1 ohne die natürliche Leadersequenz in-frame in den Bait-Vektor pGBKT7 kloniert. Anschließend wurde das Bait-Konstrukt in den Hefestamm Sacharomyces cerevisiae AH109 transformiert. Die korrekte Protein-Expression von PRV-1 in S. cerevisiae wurde durch Western Blots mit Antikörpern gegen PRV-1 und das im Bait-Vektor kodierte c-myc Tag überprüft. Nach Phänotypentestung des bait-tragenden Hefestammes wurde das Screening einer "Pretransformed cDNA Human Bone Marrow Library" durch Mating durchgeführt. Insgesamt wurden dabei 307, auf Quadrupel Dropout Medium wachstumsfähige, Kolonien gefunden. Aus drei exemplarischen Kolonien wurden dann die Prey-Plasmide in einem zweischrittigen Prozess aufgereinigt und die funktionelle Prey-Bait-Interaktion ihres Proteinproduktes nach Retransfomation bestätigt. Nach Sequenzierung konnten die Prey-Plasmide schließlich durch Datenbankabgleich, soweit bekannt, identifiziert werden. <br>Um mehr über das Gen AB3 heraus zu finden, sollte mittels einer 5' RACE mehr Sequenzinformation von AB3 aufgeklärt werden. 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In dieser Arbeit wurden zwei dieser Kandidatengene, PRV-1 (Projekt I) und AB3 (Projekt II), näher untersucht.
Um Aussagen über die Funktion von PRV-1 treffen zu können, sollten mittels eines Verfahrens zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen potentielle Bindungspartner von PRV-1 aufgespürt werden. Aufgrund der verhältnismäßig physiologischen Bedingungen wurde hierzu eine Yeast-two-hybrid-Screen verwendet. Dabei wurde PRV-1 ohne die natürliche Leadersequenz in-frame in den Bait-Vektor pGBKT7 kloniert. Anschließend wurde das Bait-Konstrukt in den Hefestamm Sacharomyces cerevisiae AH109 transformiert. Die korrekte Protein-Expression von PRV-1 in S. cerevisiae wurde durch Western Blots mit Antikörpern gegen PRV-1 und das im Bait-Vektor kodierte c-myc Tag überprüft. Nach Phänotypentestung des bait-tragenden Hefestammes wurde das Screening einer \"Pretransformed cDNA Human Bone Marrow Library\" durch Mating durchgeführt. Insgesamt wurden dabei 307, auf Quadrupel Dropout Medium wachstumsfähige, Kolonien gefunden. Aus drei exemplarischen Kolonien wurden dann die Prey-Plasmide in einem zweischrittigen Prozess aufgereinigt und die funktionelle Prey-Bait-Interaktion ihres Proteinproduktes nach Retransfomation bestätigt. Nach Sequenzierung konnten die Prey-Plasmide schließlich durch Datenbankabgleich, soweit bekannt, identifiziert werden.
Um mehr über das Gen AB3 heraus zu finden, sollte mittels einer 5' RACE mehr Sequenzinformation von AB3 aufgeklärt werden. Durch einen, mit einer 32P-gelabelten AB3-Sonde hybridisierten, Northern Territory RNA Blot gelang es, Lungengewebe als ein Gewebe zu identifizieren, in dem AB3 deutlich exprimiert wird. In vier Runden 5-RACE mit der \"Marathon Ready cDNA Library: Human Lung\" gelang es insgesamt 4230bp neue 5'cDNA-Sequenz aufzuklären und die bekannte AB3 cDNA-Sequenz damit von 3441bp auf 7671bp zu verlängern. Durch Datenbankvergleiche mit anderen Genen konnten zwei Domänen postuliert werden. Zusammenfassend handelt es sich bei AB3 wahrscheinlich um eine Tyrosinkinase mit C-terminaler katalytischer Tyrosinkinasedomäne und etwas N-terminalerer leucin-rich repeat Domäne. Da innerhalb der bekannten Sequenz keine Transmembran-Domäne gefunden wurde, könnte AB3 somit als intrazelluläre Tyrosinkinase an der Signaltransduktion beteiligt sein.","Looking for the molecular cause of the disease \"polycythemia vera\" several candidate genes were identified in a screening process (subtractive hybridization). In this work two of these candidate genes, PRV-1 (project 1) and AB3 (project 2), were further analysed.
To clarify the function of PRV-1, partners of protein-protein-interaction should be identified. The yeast-two hybrid assay was used due to the relatively physiologic conditions under which the interactions take place in this assay. PRV-1 without its natural leadersequence was cloned into the bait vector pGBKT7. The construct was then transfected into the yeast strain saccharomyces cerevisiae AH109. The correct protein expression of PRV-1 in yeasts was verified by Western Blot using antibodies against PRV-1 and c-myc, a tag included in the vector. On different dropout media the expected phenotype of the bait-vector carrying yeasts could be demonstrated before screening a \"pretransformed cDNA Human bone marrow library\". The screening was performed by mating the bait carrying yeasts with the library cells. In total 307 colonies were able to grow on quadruple dropout medium. For three of these colonies the prey-plasmid was isolated in a two-step process. The plasmid was sequenced and the gene could be identified comparing the sequence with existing databases. The interaction of these to candidates could be confirmed after retransformation.
To investigate further on AB3, more sequence information should be gathered using the 5'RACE-technique (Rapid amplification of cDNA ends). In addition a multi tissue Northern blot was probed with a ³²P-labeled AB3-probe. Lung tissue could be identified as a tissue with a high AB3-expression. It was possible to prolong the known sequence of AB3 from 3441bp to 7671bp after four rounds of 5'RACE using the \"Marathon Ready cDNA Library, Human Lung\". Comparing the sequence with databases, containing information about motifs and other genes, two domains could be postulated. In summary AB3 is probably a tyrosine kinase with a C-terminal catalytic tyrosine kinase domain and with a N-terminal leucin-rich domain. As no transmembrane domain could be found within the known sequence, AB3 could be an intracellular tyrosine kinase participating in signal transduction."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Untersuchung von PRV-1 auf Protein-Protein-Interaktions-partner im Yeast-Two-Hybrid Assay und weitere Aufklärung der 5'cDNA-Sequenz einer potentiellen Tyrosinkinase","Investigation of PRV-1 for partners of protein-protein-interaction in the Yeast-Two-Hybrid assay and further exploration of the 5'cDNA-sequence of a potential tyrosine kinase"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Pahl, Heike-L."],"dc:creator":["Buchkremer, Stefan"],"dc:description.abstract":["Auf der Suche nach der molekularbiologischen Ursache der Erkrankung \"Polycythaemia vera\" wurden mehrere Kandidatengene in einem Screening-Verfahren (Subtraktive Hybridisierung) gefunden. In dieser Arbeit wurden zwei dieser Kandidatengene, PRV-1 (Projekt I) und AB3 (Projekt II), näher untersucht.
Um Aussagen über die Funktion von PRV-1 treffen zu können, sollten mittels eines Verfahrens zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen potentielle Bindungspartner von PRV-1 aufgespürt werden. Aufgrund der verhältnismäßig physiologischen Bedingungen wurde hierzu eine Yeast-two-hybrid-Screen verwendet. Dabei wurde PRV-1 ohne die natürliche Leadersequenz in-frame in den Bait-Vektor pGBKT7 kloniert. Anschließend wurde das Bait-Konstrukt in den Hefestamm Sacharomyces cerevisiae AH109 transformiert. Die korrekte Protein-Expression von PRV-1 in S. cerevisiae wurde durch Western Blots mit Antikörpern gegen PRV-1 und das im Bait-Vektor kodierte c-myc Tag überprüft. Nach Phänotypentestung des bait-tragenden Hefestammes wurde das Screening einer \"Pretransformed cDNA Human Bone Marrow Library\" durch Mating durchgeführt. Insgesamt wurden dabei 307, auf Quadrupel Dropout Medium wachstumsfähige, Kolonien gefunden. Aus drei exemplarischen Kolonien wurden dann die Prey-Plasmide in einem zweischrittigen Prozess aufgereinigt und die funktionelle Prey-Bait-Interaktion ihres Proteinproduktes nach Retransfomation bestätigt. Nach Sequenzierung konnten die Prey-Plasmide schließlich durch Datenbankabgleich, soweit bekannt, identifiziert werden.
Um mehr über das Gen AB3 heraus zu finden, sollte mittels einer 5' RACE mehr Sequenzinformation von AB3 aufgeklärt werden. Durch einen, mit einer 32P-gelabelten AB3-Sonde hybridisierten, Northern Territory RNA Blot gelang es, Lungengewebe als ein Gewebe zu identifizieren, in dem AB3 deutlich exprimiert wird. In vier Runden 5-RACE mit der \"Marathon Ready cDNA Library: Human Lung\" gelang es insgesamt 4230bp neue 5'cDNA-Sequenz aufzuklären und die bekannte AB3 cDNA-Sequenz damit von 3441bp auf 7671bp zu verlängern. Durch Datenbankvergleiche mit anderen Genen konnten zwei Domänen postuliert werden. Zusammenfassend handelt es sich bei AB3 wahrscheinlich um eine Tyrosinkinase mit C-terminaler katalytischer Tyrosinkinasedomäne und etwas N-terminalerer leucin-rich repeat Domäne. Da innerhalb der bekannten Sequenz keine Transmembran-Domäne gefunden wurde, könnte AB3 somit als intrazelluläre Tyrosinkinase an der Signaltransduktion beteiligt sein.","Looking for the molecular cause of the disease \"polycythemia vera\" several candidate genes were identified in a screening process (subtractive hybridization). In this work two of these candidate genes, PRV-1 (project 1) and AB3 (project 2), were further analysed.
To clarify the function of PRV-1, partners of protein-protein-interaction should be identified. The yeast-two hybrid assay was used due to the relatively physiologic conditions under which the interactions take place in this assay. PRV-1 without its natural leadersequence was cloned into the bait vector pGBKT7. The construct was then transfected into the yeast strain saccharomyces cerevisiae AH109. The correct protein expression of PRV-1 in yeasts was verified by Western Blot using antibodies against PRV-1 and c-myc, a tag included in the vector. On different dropout media the expected phenotype of the bait-vector carrying yeasts could be demonstrated before screening a \"pretransformed cDNA Human bone marrow library\". The screening was performed by mating the bait carrying yeasts with the library cells. In total 307 colonies were able to grow on quadruple dropout medium. For three of these colonies the prey-plasmid was isolated in a two-step process. The plasmid was sequenced and the gene could be identified comparing the sequence with existing databases. The interaction of these to candidates could be confirmed after retransformation.
To investigate further on AB3, more sequence information should be gathered using the 5'RACE-technique (Rapid amplification of cDNA ends). In addition a multi tissue Northern blot was probed with a ³²P-labeled AB3-probe. Lung tissue could be identified as a tissue with a high AB3-expression. It was possible to prolong the known sequence of AB3 from 3441bp to 7671bp after four rounds of 5'RACE using the \"Marathon Ready cDNA Library, Human Lung\". Comparing the sequence with databases, containing information about motifs and other genes, two domains could be postulated. In summary AB3 is probably a tyrosine kinase with a C-terminal catalytic tyrosine kinase domain and with a N-terminal leucin-rich domain. As no transmembrane domain could be found within the known sequence, AB3 could be an intracellular tyrosine kinase participating in signal transduction."],"dc:format.medium":["application/pdf"],"dc:subject":["RACE","myeloproliferative syndrome","Yeast-Two-Hybrid-System","Cancer research","Non receptor tyrosine kinase, protein-tyrosine-kinase, RACE"],"dc:title":["Untersuchung von PRV-1 auf Protein-Protein-Interaktions-partner im Yeast-Two-Hybrid Assay und weitere Aufklärung der 5'cDNA-Sequenz einer potentiellen Tyrosinkinase","Investigation of PRV-1 for partners of protein-protein-interaction in the Yeast-Two-Hybrid assay and further exploration of the 5'cDNA-sequence of a potential tyrosine kinase"],"dc:type":["DoctoralThesis"]},"updated_at":"2026-07-24T02:22:46Z"}