Tissue Engineering von Skelettmuskulatur : Vergleich eines in vitro und in vivo Ansatzes

Neue Ansätze, um Muskeldefekte bei angeborenen und erworbenen Erkrankungen der Skelettmuskulatur im Sinne des Tissue Engineering zu therapieren, könnten in der Implantation von in vitro generiertem, differenziertem Skelettmuskelgewebe oder in der Injektion von Satellitenzellen oder anderen Muskelvorläuferzellen (Stammzellen) in die erkrankten Gewebeanteile bestehen, um anschließend die Formierung von funktionellem Muskelgewebe zu erreichen. <br>Im ersten Ansatz der vorliegenden Arbeit wurde versucht mit Hilfe der Elektrostimulation von Muskelvorläuferzellen in einer 3D-Fibrinmatrix die Differenzierung der Zellen zu etablieren und zu untersuchen. Vorteil dieser Methode gegenüber bisherigen Differenzierungsstimuli (neuronales Gewebe, Matrigel®) ist, dass sie im klinischen Bereich Anwendung finden könnte. Als Differenzierungsmarker dienten die Transkriptionsfaktoren der Myogenese MyoD und Myogenin als auch die Expression der Epsilon-Untereinheit des adulten Azetylcholinrezeptors. <br>Zunächst wurde die Genexpression der Muskelvorläuferzellen in 2D-Zellkultur und 3D-Fibrinkultur untersucht und verglichen, dabei konnte festgestellt werden, dass sich MyoD und Myogenin in der 3D-Kultur im Gegensatz zur 2D-Kultur stets nachweisen lassen. Die Azetylcholinrezeptoruntereinheit-Epsilon konnte sowohl in der 2D als auch in der 3D-Kultur nachgewiesen werden. Da Fibrin allein nicht zur Differenzierung von Myoblasten zu kontraktilen Myofibrillen ausreicht, wurde über eine Genexpressions- und Proteinanalyse der Einfluss der Elektrostimulation, die sich für die Zelldifferenzierung in 2D-Kulturen als aussichtsreich darstellte, an Myoblasten in einer 3D-Fibrin-Matrix untersucht. Als Ergebnis lässt sich festhalten, dass die Elektrostimulation tendenziell die Expression von MyoD, Myogenin und der Azetylcholinrezeptoruntereinheit-Epsilon herunterreguliert. Die Proteinform der Differenzierungsmarker konnte in den Myoblasten nicht nachgewiesen werden. Auch Trisk 51, ein Komplex des Ryanodin-Triadin-Rezeptors des sarkoplasmatischen Retikulums, sowie die embryonale Isoform der Myosin-Schwerkette (MHC) wurden nicht exprimiert. Alle diese Versuche wurden mit hoch und niedrig passagierten Myoblasten (P2 versus P4) durchgeführt und analysiert, wobei tendenziell in niedrig passagierten Myoblasten die Differenzierungsinduktion, die anhand der Expressionswerte ermittelt wurde, als leichter angesehen werden kann. <br>Im zweiten Ansatz dieser Arbeit wurden Myoblastensuspensionen innerhalb einer dreidimensionalen in-situ sich ausformenden Fibrinmatrix mit Hilfe einer Zweikanal-Spritze (Duploject® Spritzensystem) in Muskeldefekte von 24 syngenen Ratten appliziert. Das Überlebensschicksal der primären Myoblasten wurde anhand eines trans-gender Modells verfolgt, wobei männliche Myoblasten auf weibliche Tiere transplantiert wurden und das Y-Chromosom als Marker fungierte. Die Integrationsraten der Zellen wurden nach zwei Tagen und zwei, sechs und zwölf Wochen nach der Transplantation mittels ISH ermittelt und mit sieben Tagen vorkultivierten Myoblasten-Fibrin Konstrukten verglichen. Nach der Injektion behielten die Zellen ihren myogenen Phänotyp (Anti-Desmin Färbung positiv) und es gab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Integrationsraten im Vergleich zu sieben Tagen vorkultivierten Konstrukten.

Author dc:creator

• Stern-Sträter, Jens

Contributors dc:contributor

• Stark, Gerhard Björn

• tissue engineering
• skeletal muscle
• differentiation
• electrical stimulation

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