Strukturelle und mechanistische Arbeiten an Triterpen-Cyclasen aus Alicyclobacillus acidocaldarius und Arabidopsis thaliana sowie Kristallstrukturen der katalytischen Fragmente von AB-Toxinen aus Clostridium difficile und Bacillus sphaericus

Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Kristallstruktur der Squalen-Hopen-Cyclase aus Alicyclobacillus acidocaldarius (baSHC) im Komplex mit dem Substratanalogon 2,3-Dihydro-2-azasqualen gelöst werden. Die bei einer Auflösungsgrenze von 2.1 Å ermittelte Kristallstruktur zeigte den Bindungsmodus des Inhibitors im Detail und erlaubte aufgrund der Ähnlichkeit zum natürlichen Substrat Squalen Rückschlüsse auf dessen Wechselwirkungen mit der Cyclase. 2,3-Dihydro-2-azasqualen bindet in einer definierten, präorganisierten Konformation im aktiven Zentrum der baSHC und bestätigt damit weitgehend den allgemein erwarteten Bindungsmodus von Squalen sowie die postulierte strikte enzymatische Kontrolle der baSHC, die als essentiell für die hohe Regio- und Stereoselektivität angesehen wird. Anhand einer eingehenden Analyse der Struktur konnten Vorschläge zum Reaktionsmechanismus der baSHC gemacht werden. Des weiteren wurde an der Präparation und Kristallisation der Cycloartenol-Synthase aus Arabidopsis thaliana (atCAS) gearbeitet, die aufgrund ihrer hohen Homologie zur humanen Oxidosqualen-Cyclase (hOSC) als Modellsystem für diese von Interesse war. Unterschiedliche Hefe-Expressionssysteme wurden auf ihre Eignung zur Präparation der atCAS für die Kristallisation getestet. Zwei Kristallisationsbedingungen konnten aufgefunden und verfeinert werden. Die erhaltenen Kristalle wiesen allerdings eine schlechte Reproduzierbarkeit auf und zeigten keinerlei Diffraktionsvermögen. Die Arbeiten wurden beendet als die Kristallstruktur der hOSC veröffentlicht wurde. <br>Dafür wurden Strukturanalysen an zwei AB-Toxinen aufgenommen. Die Struktur des katalytischen Fragments von Toxin B aus Clostridium difficile konnte im Komplex mit dem Kofaktor Mn2+ und dem Kosubstrat UDP-Glucose bei einer Auflösung von 2.2 Å bestimmt werden. TcdB gehört der Familie der großen clostridialen Toxine an und modifiziert kleine GTP-bindende Proteine des Wirts durch Transfer einer als UDP-Zucker aktivierten Glucose. Die Strukturlösung gelang durch die Kombination von Phasensätzen zweier Schweratomderivate auf Basis eines vorläufigen Modells, da die hohe Nicht-Isomorphie der Datensätze die übliche Phasenbestimmung durch multiplen isomorphen Ersatz nicht zuließ. Die zentrale Domäne des Toxins weist die charakteristische alpha/beta-Faltung der Glycosyltransferasen des GT-A-Typs auf und enthält das aktive Zentrum. Unter Berücksichtigung von Strukturvergleichen und biochemischen Daten wurde ein Katalysemechanismus vorgeschlagen. Zudem konnte die unterschiedliche Kosubstratspezifität der Vertreter der großen clostridialen Toxine aufgeklärt und ein Vorschlag zur Komplexgeometrie mit einem der Zielproteine erarbeitet werden. Weiterhin konnte die Struktur der katalytischen A-Komponente des moskitoziden Toxins aus Bacillus sphaericus (MTX) in drei Kristallformen bei Auflösungen von 2.5-3.0 Å gelöst werden. MTX gehört zur Familie der ADP-Ribosyltransferasen (ARTs), die Wirtsproteine durch Transfer von ADP-Ribose modifizieren. In zwei Fällen erfolgte die Phasierung durch die Methode der anomalen Streuung bei einer bzw. mehreren Wellenlängen, wobei das anomale Streuverhalten von Selen-Atomen ausgenutzt wurde. Anschließend konnte die dritte Kristallform durch molekularen Ersatz gelöst werden. In zwei der Kristallstrukturen liegt MTX in Form C7-symmetrischer Ringe vor, die wiederum zu D7-Tetrameren assoziieren. Das aktive Zentrum der ART konnte durch Strukturvergleiche und biochemische Daten eindeutig identifiziert werden. In allen drei Kristallformen wird die Bindestelle des Kosubstrats NAD+ durch einen C-terminalen Abschnitt des kristallisierten Fragments blockiert, womit der experimentell ermittelte kompetitive Inhibitionstyp dieses Segments strukturell begründet werden konnte. Für das Holotoxin wurde im Rahmen der Arbeit ein plausibles Modell erarbeitet, das im Einklang mit biochemischen Daten steht.

Author dc:creator

• Reinert, Dirk J.

Contributors dc:contributor

• Schulz, Georg E.

• structural biology
• squalen-hopene cyclase
• glycosyl transferase
• ADP-ribosyl transferase

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