In vitro-Untersuchungen zum Sekretionsmechanismus von Pathogenitätsfaktoren mit einer N-terminalen Extension in Escherichia coli

Das Gram-negative Bakterium Escherichia coli besitzt vier verschiedene Zellkompartimente: das Cytoplasma, die Cytoplasmamembran (Innenmembran), den periplasmatischen Raum sowie die Außenmembran. Aufgrund dieser Kompartimentierung muss die Zelle über spezifische Transportmechanismen verfügen, um die im Cytoplasma synthetisierten Proteine in den periplasmatischen Raum, in das extrazelluläre Medium oder in eine der beiden Membranen zu transportieren. <br>Für die Zielsteuerung (Targeting) ungefalteter Proteine an, und ihren anschließenden Transport über bzw. ihre Integration in die Innenmembran, sind unterschiedliche Transportwege beschrieben. <br>1. Sekretorische Proteine (periplasmatische und Außenmembran-Proteine) werden während ihrer Synthese am Ribosom von dem Chaperon Trigger Factor gebunden. Für die anschließende post-translationale Zielsteuerung an die Innenmembran sind SecB und SecA verantwortlich. Die nachfolgende Translokation der Proteine durch das SecYEG-Translokon wird von SecA energetisiert. <br>2. Das bakterielle signal recognition particle (SRP) und sein Rezeptor FtsY vermitteln sowohl die co-translationale Zielsteuerung polytoper Innenmembranproteine an, als auch ihre Integration in das SecYEG-Translokon und die Innenmembran. <br>Nicht alle Innenmembranproteine sind jedoch ausschließlich auf SRP angewiesen. So ist die Integration polytoper Innenmembranproteine mit großen periplasmatischen Domänen von einer Kooperation zwischen SRP und SecA abhängig. SRP ist hier für die Zielsteuerung der Proteine an die Innenmembran verantwortlich, während SecA die Translokation der großen periplasmatischen Domänen vermittelt. <br>Uneinigkeit besteht, ob es in Bakterien sekretorische Proteine gibt, an deren Zielsteuerung SRP beteiligt ist. Hierzu gehören auch jene sekretorischen Proteine, zu deren Klasse die in dieser Arbeit untersuchten Proteine FHA aus Bordetella pertussis und SepA aus Shigella flexneri gehören. Hierbei handelt es sich um Autotransporter bzw. TpsA Proteine, die sich einerseits durch eine enorme Proteinlänge, andererseits durch eine stark positiv geladene und lange N-Region innerhalb der Signalsequenz, sowie durch eine N-terminale Extension, die der Signalsequenz am N-terminalen Ende vorausgeht, auszeichnen. <br>In dieser Arbeit wurde unter Verwendung eines homologen Transkriptions-Translationssystems von E. coli erstmalig der Sekretionsweg dieser Proteine am Beispiel von FHA und SepA in vitro analysiert. <br>Eine effiziente Interaktion zwischen SRP und naszierenden Ketten von FHA und SepA konnte nicht beobachtet werden. Vielmehr ist es das ribosomenassoziierte Chaperon Trigger Factor, das mit naszierenden Ketten von FHA und SepA interagiert. Zielsteuerung und Translokation geschehen abhängig von SecA und SecB und unabhängig von SRP. Gezeigt wurde ebenfalls, dass die N-terminale Extension den Sekretionsmodus von FHA in diesem E. coli in vitro System nicht beeinflusste. <br>Die Ergebnisse dieser Arbeit bekräftigen die Theorie einer zellinternen Unterscheidung zweier verschiedener Protein-Transportwege in Bakterien: die SRP vermittelte Integration von Innenmembranproteinen und den SecA abhängigen Transport sekretorischer Proteine. Die hier beschriebenen Untersuchungen haben somit keinen Hinweis darauf erbracht, dass es in Gram-negativen Bakterien sekretorische, SRP-abhängige Proteine gibt. <br>Obwohl eine funktionelle Beteiligung von SRP sicher ausgeschlossen werden konnte, ergaben sich Hinweise auf ein mögliches co-translationales Targeting der Proteine an die Innenmembran. Dieses wäre insofern günstig, als dadurch eine schnelle Proteintranslokation über die Innenmembran sichergestellt und das Risiko einer zytotoxischen Aggregation solch großer Proteine im Cytoplasma verringert würde. Der genaue Mechanismus eines solchen, SRP unabhängigen, co-translationalen Targetings ist bislang nicht geklärt; diskutiert wird in dieser Arbeit jedoch über eine Beteiligung von SecB.

Author dc:creator

• Chevalier, Nina

Contributors dc:contributor

• Müller, Matthias

• Autotransport
• Innenmembran gramnegativer Bakterien
• Typ V Sekretion
• N-terminale Extension
• inner membrane of gram negative bacteria
• Type V secretion
• N-terminal extension

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