3D-DNA-Chips : oberflächengebundene funktionelle Polymernetzwerke als Matrix für Nukleinsäure-Microarrays

In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe von photovernetzbaren Polymeren, polymere unfunktionelle Materialen so beschichtet, dass sie als Substrate für DNA-Chips eingesetzt werden können. Die photovernetzbaren Polymere basieren auf N,N?-Dimethylacrylamid als Monomer und sind über radikalische Polymerisation hergestellt worden. Indem geeignete Monomere copolymerisiert werden, können Ladungen, reaktive oder hydrophobe Gruppen eingeführt worden. Benzophenonhaltige Monomere sorgen dafür, dass die Polymere als Film auf polymeren Substraten vernetzt werden können. Der Quellgrad der resultierenden Gele kann über die Zahl der photovernetzbaren Gruppen gezielt eingestellt werden. Die Polymere sind spektroskopisch hinsichtlich der gewünschten Funktionalität charakterisiert worden. Die polymeren Substrate sind tauchbeschichtet worden, wobei untersucht worden ist, wie Parameter wie die Konzentration, das Lösungsmittel oder die Zuggeschwindigkeit mit den Schichtdicken und Morphologien der Polymerfilme zusammen hängen. Die Analyse der Filme über Röntgenreflektometrie, Ellipsometrie oder AFM, konnte zeigen, dass homogene Filme mit kontrollierter Morphologie abgeschieden werden können. Das entwickelte Konzept, erlaubt organische Filme aufzubauen, die wiederum aus Multilagen einzelner Polymerschichten bestehen. Dabei kann die Zahl der Einzelschichten, die jeweilige Schichtdicke und Schichtabfolge willkürlich gewählt werden. Der regelmäßige Aufbau der Polymermultilagen konnte auch direkt mit Hilfe von Röntgenreflektometrie belegt werden. Die Kinetik der Photoreaktion und die Zahl der Benzophenongruppen ist bestimmt worden, um das Quellverhalten der Netzwerke quantitativ auswerten zu können. Ein Ziel der Arbeit war es auch, zu überprüfen, ob die entwickelten DNA-Chips konventionellen medium-density DNA-Microarrays hinsichtlich der Flexibilität der Anwendungen und der Eigenschaften überlegen sind. Um die Signalintensität zu steigern, müssen die Sondenmoleküle in einem quellfähigen dreidimensionalen Netzwerk immobilisiert sein. Es konnte gezeigt werden, dass die Porengröße über die Zahl der photoreaktiven Gruppen gesteuert werden kann und dass die experimentellen Ergebnisse mit Hilfe der Flory-Rehner-Theorie zum Quellverhalten von Gelen theoretisch beschrieben werden können. Experimenten zum Quellverhalten der Gele und zur Diffusion von Oligonukleotiden in Gelen konnte belegen, dass Polymere mit einem Anteil von 1% photoreaktiver Gruppen formstabile Gele bilden, deren Porengröße ausreichend groß ist, so dass Oligonukleotide ungehindert diffundieren können und dass das Quellverhalten der Gele durch die verwendeten Printpuffer nicht beeinflusst wird. Der Vergleich des Quellverhaltens von oberflächengebundenen Gelen und von freien in drei Raumrichtungen quellenden Gelen zeigt, wie die Bindung zu einer Oberfläche die Quellfähigkeit beeinflusst. Der Effekt der Oberfläche konnte mit einem auf der Flory-Rehner-Theorie basierenden Skalierungsgesetz erfasst werden. Die beschichteten Substrate sind im Kontaktdruckverfahren nach der ex-situ-Methode eingesetzt worden, um DNA-Microarrays herzustellen. Die niedrige Hintergrundfluoreszenz der beschichteten DNA-Chips gewährleistete ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis. Durch die systematische Variation von Oberflächeneigenschaften, Sonden und Puffersystem, ist zunächst an einem Oligonukleotidsystem quantitativ untersucht worden, wie die Oberflächeneigenschaften die Hybridisierungseffizienz oder die Druck-Qualität beeinflussen. Eines der wichtigsten Ergebnisse ist, dass die Menge der gebundenen Oligonukleotide bei den quellfähigen Oberflächen über die Konzentration der gedruckten Sonden gesteuert werden kann. Die Menge der detektierten Oligonukleotide steigt im Gegensatz zu nicht-quellfähigen Oberflächen linear mit der Konzentration der Sonden an. Mikrostrukturierte DNA-Polymerkonjugate konnten in einem Schritt hergestellt werden, indem eine Lösung des photovernetzbaren Polymers und der DNA-Sonden gedruckt wird. Anstelle komplett beschichteter Oberflächen, werden Geltropfen erhalten, die bereits die Sondenmoleküle in der gewünschten Konzentration enthalten. In einem Schritt werden sowohl die Polymere auf der Oberfläche gebunden als auch die Sonden in dem Netzwerk fixiert. Die Oberflächen, die sich anhand der Testarrays als erfolgreich erwiesen haben sind auch in praktischen Anwendungen zu genmodifizierten Organismen (GMO) und zur Genexpression (GE) getestet worden. Bei beiden Chipsorten konnte eine erhöhte integrale Signalintensität erreicht werden. Insbesondere Oberflächen mit aminoreaktiven Gruppen oder gut quellfähige Oberflächen führen dazu, dass deutlich mehr Analytmoleküle detektiert werden können. Die Effekte müssen jedoch je nach Sonde und Oberfläche differenziert betrachtet werden, so dass es gelingt, das Druckbild und die Signalintensität für die jeweilige Anwendung zu optimieren.

Author dc:creator

• Freidank, Daniel

Contributors dc:contributor

• Rühe, Jürgen

• Quellverhalten
• polymer coating
• DNA-chip
• microarra y, swelling
• gel

Repository record source_url

https://freidok.uni-freiburg.de/data/1885

OAI identifier oai:identifier

oai:freidok.uni-freiburg.de:1885