Mutagenese des nuo-Operons von Escherichia coli

Die protonenpumpende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) koppelt den Transfer der Elektronen des NADH über ein Flavinmononukleotid und neun Eisen-Schwefel (Fe/S)-Zentren auf ein Chinon mit der Translokation von vier Protonen über die Membran. Aufgrund fehlender Strukturdaten und seines komplexen Aufbaus ist der Mechanismus noch nicht verstanden. Der Komplex I aus dem Bakterium Escherichia coli besteht aus 13 verschiedenen Untereinheiten NuoA bis NuoN, die von den Genen des 15 kbp großen nuo-Operons kodiert werden. Die Gene nuoC und nuoD sind in E. coli zu einem Gen fusioniert. <br> <br>Das nuo-Operon wurde in den Expressionvektor pBAD33 kloniert und die nuo-Gene extrachromosomal exprimiert. Dies führte zu der Produktion eines funktionellen Komplex I. Es wurden Subklone der Gene nuoA bis nuoM´ hergestellt, die mittels PCR mutiert und in den Expressionsvektor rückkloniert werden sollten. Dies war aufgrund fehlender Zwischenvektoren nur für die Gene nuoA bis nuoE´ möglich. Die Mutationen auf den übrigen Genen wurden über die sogenannte l-Red vermittelte Rekombination in das Expressionsplasmid eingefügt. <br> <br>Die Untereinheiten NuoB, NuoC und NuoF wurden jeweils C-terminal mit einem Affinitäts-Peptid modifiziert, um den Komplex über eine Affinitätschromatographie aufzureinigen. Dieses Peptid verhinderte die Assemblierung, destabilisierte den Komplex oder wurde nicht von dem Säulenmaterial gebunden. Für eine schnelle und effiziente Aufreinigung des Komplexes muß das Peptid an andere Untereinheiten fusioniert werden. Die Deletion der Gene nuoCD, nuoG, nuoM und der Gengruppe nuoE bis nuoF verhinderte jeweils die Assemblierung des Komplex I. Das Cytosol der DnuoCD Mutante enthielt ein lösliches Fragment des Komplexes. Weitere Deletionen werden zeigen, welche Gene für die Assemblierung dieses Fragmentes benötigt werden. <br> <br>Die Cysteine eines zusätzlichen Bindemotivs für ein Fe/S-Zentrum auf der Untereinheit NuoG wurden gegen Alanine ausgetauscht. Die ESR-spektroskopische Charakterisierung der mutierten Proteine zeigte, dass das ESR-Signal, das diesem Motiv zugeordnet wurde, von einem Zentrum der Untereinheit NuoE stammt. Da die Mutationen die Assemblierung störten, bindet das zusätzliche Bindemotiv auf NuoG wahrscheinlich ein bislang nicht nachgewiesenes Fe/S-Zentrum.

Author dc:creator

• Uhlmann, Mareike

Contributors dc:contributor

• Friedrich, Thorsten

• Lambda-Red vermittelte Rekombination
• NADH:Ubichinon Oxidoreduktase
• Lambda-Red mediated recombination
• NADH:ubiquinone oxidoreductase

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