{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1797"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1797","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Mutagenese des nuo-Operons von Escherichia coli","abstract":"Die protonenpumpende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) koppelt den Transfer der Elektronen des NADH über ein Flavinmononukleotid und neun Eisen-Schwefel (Fe/S)-Zentren auf ein Chinon mit der Translokation von vier Protonen über die Membran. Aufgrund fehlender Strukturdaten und seines komplexen Aufbaus ist der Mechanismus noch nicht verstanden. Der Komplex I aus dem Bakterium Escherichia coli besteht aus 13 verschiedenen Untereinheiten NuoA bis NuoN, die von den Genen des 15 kbp großen nuo-Operons kodiert werden. Die Gene nuoC und nuoD sind in E. coli zu einem Gen fusioniert.
Das nuo-Operon wurde in den Expressionvektor pBAD33 kloniert und die nuo-Gene extrachromosomal exprimiert. Dies führte zu der Produktion eines funktionellen Komplex I. Es wurden Subklone der Gene nuoA bis nuoM´ hergestellt, die mittels PCR mutiert und in den Expressionsvektor rückkloniert werden sollten. Dies war aufgrund fehlender Zwischenvektoren nur für die Gene nuoA bis nuoE´ möglich. Die Mutationen auf den übrigen Genen wurden über die sogenannte l-Red vermittelte Rekombination in das Expressionsplasmid eingefügt.
Die Untereinheiten NuoB, NuoC und NuoF wurden jeweils C-terminal mit einem Affinitäts-Peptid modifiziert, um den Komplex über eine Affinitätschromatographie aufzureinigen. Dieses Peptid verhinderte die Assemblierung, destabilisierte den Komplex oder wurde nicht von dem Säulenmaterial gebunden. Für eine schnelle und effiziente Aufreinigung des Komplexes muß das Peptid an andere Untereinheiten fusioniert werden. Die Deletion der Gene nuoCD, nuoG, nuoM und der Gengruppe nuoE bis nuoF verhinderte jeweils die Assemblierung des Komplex I. Das Cytosol der DnuoCD Mutante enthielt ein lösliches Fragment des Komplexes. Weitere Deletionen werden zeigen, welche Gene für die Assemblierung dieses Fragmentes benötigt werden.
Die Cysteine eines zusätzlichen Bindemotivs für ein Fe/S-Zentrum auf der Untereinheit NuoG wurden gegen Alanine ausgetauscht. Die ESR-spektroskopische Charakterisierung der mutierten Proteine zeigte, dass das ESR-Signal, das diesem Motiv zugeordnet wurde, von einem Zentrum der Untereinheit NuoE stammt. Da die Mutationen die Assemblierung störten, bindet das zusätzliche Bindemotiv auf NuoG wahrscheinlich ein bislang nicht nachgewiesenes Fe/S-Zentrum.","abstract_html":"Die protonenpumpende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) koppelt den Transfer der Elektronen des NADH über ein Flavinmononukleotid und neun Eisen-Schwefel (Fe/S)-Zentren auf ein Chinon mit der Translokation von vier Protonen über die Membran. Aufgrund fehlender Strukturdaten und seines komplexen Aufbaus ist der Mechanismus noch nicht verstanden. Der Komplex I aus dem Bakterium Escherichia coli besteht aus 13 verschiedenen Untereinheiten NuoA bis NuoN, die von den Genen des 15 kbp großen nuo-Operons kodiert werden. Die Gene nuoC und nuoD sind in E. coli zu einem Gen fusioniert. <br> <br>Das nuo-Operon wurde in den Expressionvektor pBAD33 kloniert und die nuo-Gene extrachromosomal exprimiert. Dies führte zu der Produktion eines funktionellen Komplex I. Es wurden Subklone der Gene nuoA bis nuoM´ hergestellt, die mittels PCR mutiert und in den Expressionsvektor rückkloniert werden sollten. Dies war aufgrund fehlender Zwischenvektoren nur für die Gene nuoA bis nuoE´ möglich. Die Mutationen auf den übrigen Genen wurden über die sogenannte l-Red vermittelte Rekombination in das Expressionsplasmid eingefügt. <br> <br>Die Untereinheiten NuoB, NuoC und NuoF wurden jeweils C-terminal mit einem Affinitäts-Peptid modifiziert, um den Komplex über eine Affinitätschromatographie aufzureinigen. Dieses Peptid verhinderte die Assemblierung, destabilisierte den Komplex oder wurde nicht von dem Säulenmaterial gebunden. Für eine schnelle und effiziente Aufreinigung des Komplexes muß das Peptid an andere Untereinheiten fusioniert werden. Die Deletion der Gene nuoCD, nuoG, nuoM und der Gengruppe nuoE bis nuoF verhinderte jeweils die Assemblierung des Komplex I. Das Cytosol der DnuoCD Mutante enthielt ein lösliches Fragment des Komplexes. Weitere Deletionen werden zeigen, welche Gene für die Assemblierung dieses Fragmentes benötigt werden. <br> <br>Die Cysteine eines zusätzlichen Bindemotivs für ein Fe/S-Zentrum auf der Untereinheit NuoG wurden gegen Alanine ausgetauscht. Die ESR-spektroskopische Charakterisierung der mutierten Proteine zeigte, dass das ESR-Signal, das diesem Motiv zugeordnet wurde, von einem Zentrum der Untereinheit NuoE stammt. Da die Mutationen die Assemblierung störten, bindet das zusätzliche Bindemotiv auf NuoG wahrscheinlich ein bislang nicht nachgewiesenes Fe/S-Zentrum.","abstract_has_math":false,"creators":["Uhlmann, Mareike"],"institution":null,"degree_name":null,"degree_level":null,"degree_discipline":null,"degree_department":null,"school":null,"contributors":["Friedrich, Thorsten"],"advisors":[],"committee_chairs":[],"committee_members":[],"year":null,"date_issued":"","date_published":null,"updated_at":"2026-07-24T02:22:28Z","subjects":["Lambda-Red vermittelte Rekombination","NADH:Ubichinon Oxidoreduktase","Lambda-Red mediated recombination","NADH:ubiquinone oxidoreductase"],"languages":[],"rights":[],"rights_urls":[],"identifier_entries":[]},"links":{"outbound_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/data/1797","outbound_label":"Repository record","outbound_source":"source_url"},"metadata_groups":[{"id":"people","label":"People","entries":[{"key":"dc:contributor","label":"Contributor","values":["Friedrich, Thorsten"]},{"key":"dc:creator","label":"Author","values":["Uhlmann, Mareike"]}]},{"id":"academic_context","label":"Academic Context","entries":[{"key":"dc:type","label":"Dc Type","values":["DoctoralThesis"]}]},{"id":"subjects_keywords","label":"Subjects and Keywords","entries":[{"key":"dc:subject","label":"Dc Subject","values":["Lambda-Red vermittelte Rekombination","NADH:Ubichinon Oxidoreduktase","Lambda-Red mediated recombination","NADH:ubiquinone oxidoreductase"]}]},{"id":"additional","label":"Additional Metadata","entries":[{"key":"dc:description.abstract","label":"Abstract","values":["Die protonenpumpende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) koppelt den Transfer der Elektronen des NADH über ein Flavinmononukleotid und neun Eisen-Schwefel (Fe/S)-Zentren auf ein Chinon mit der Translokation von vier Protonen über die Membran. Aufgrund fehlender Strukturdaten und seines komplexen Aufbaus ist der Mechanismus noch nicht verstanden. Der Komplex I aus dem Bakterium Escherichia coli besteht aus 13 verschiedenen Untereinheiten NuoA bis NuoN, die von den Genen des 15 kbp großen nuo-Operons kodiert werden. Die Gene nuoC und nuoD sind in E. coli zu einem Gen fusioniert.
Das nuo-Operon wurde in den Expressionvektor pBAD33 kloniert und die nuo-Gene extrachromosomal exprimiert. Dies führte zu der Produktion eines funktionellen Komplex I. Es wurden Subklone der Gene nuoA bis nuoM´ hergestellt, die mittels PCR mutiert und in den Expressionsvektor rückkloniert werden sollten. Dies war aufgrund fehlender Zwischenvektoren nur für die Gene nuoA bis nuoE´ möglich. Die Mutationen auf den übrigen Genen wurden über die sogenannte l-Red vermittelte Rekombination in das Expressionsplasmid eingefügt.
Die Untereinheiten NuoB, NuoC und NuoF wurden jeweils C-terminal mit einem Affinitäts-Peptid modifiziert, um den Komplex über eine Affinitätschromatographie aufzureinigen. Dieses Peptid verhinderte die Assemblierung, destabilisierte den Komplex oder wurde nicht von dem Säulenmaterial gebunden. Für eine schnelle und effiziente Aufreinigung des Komplexes muß das Peptid an andere Untereinheiten fusioniert werden. Die Deletion der Gene nuoCD, nuoG, nuoM und der Gengruppe nuoE bis nuoF verhinderte jeweils die Assemblierung des Komplex I. Das Cytosol der DnuoCD Mutante enthielt ein lösliches Fragment des Komplexes. Weitere Deletionen werden zeigen, welche Gene für die Assemblierung dieses Fragmentes benötigt werden.
Die Cysteine eines zusätzlichen Bindemotivs für ein Fe/S-Zentrum auf der Untereinheit NuoG wurden gegen Alanine ausgetauscht. Die ESR-spektroskopische Charakterisierung der mutierten Proteine zeigte, dass das ESR-Signal, das diesem Motiv zugeordnet wurde, von einem Zentrum der Untereinheit NuoE stammt. Da die Mutationen die Assemblierung störten, bindet das zusätzliche Bindemotiv auf NuoG wahrscheinlich ein bislang nicht nachgewiesenes Fe/S-Zentrum.","The proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) couples the transfer of electrons from NADH over a flavine mononucleotide and up to nine iron-sulfur (Fe/S) clusters to quinone with the translocation of protons across the membrane. Because of missing structural data and of the high complexity of the enzyme its mechanism isn´t known yet. Complex I from the bacterium Escherichia coli consists of 13 subunits NuoA to NuoN that are encoded by the genes of the 15 kbp big nuo-operon. In E. coli the genes nuoC and nuoD are fused to one gene nuoCD.
The nuo-operon was cloned in the expression vector pBAD33 and the nuo-genes were expressed extrachromosomally. This led to the production of a functional complex I. Subclones of the genes nuoA to nuoM´ were made. This clones should be mutated based on PCR methods and thereupon cloned back in the expression vector. Because of missing shuttle clones this was only possible for the genes nuoA to nuoE´. Mutations in other genes were inserted into the expression plasmid by means of l-Red mediated recombination.
Subunits NuoB, NuoC and NuoF were modificated with a C-terminal affinity peptide to purify the complex through affinity chromatography. This peptide inhibited assembly, destabilized the complex or could not be bound to the gel matrix. For quick and efficient purification of the complex the peptide must be bound to other subunits. Deletion of genes nuoCD, nuoG, nuoM and the gene group nuoE to F disturbed in each case assembly of complex I. Cytoplasma of the DnuoCD mutant contained a soluble fragment of the complex. Further deletions will show which genes are required for assembly of this fragment.
Cysteines of an additional binding motif for a Fe/S cluster were changed to alanines. EPR spectroscopic characterization of the mutant proteins showed that the EPR signal assigned to this motif stems from a cluster on subunit NuoE. Because the assembly of the complex is disturbed by the mutations this motif on NuoG binds probably a so far not detected Fe/S cluster."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Mutagenese des nuo-Operons von Escherichia coli","Mutagenesis of the nuo-operon from Escherichia coli"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Friedrich, Thorsten"],"dc:creator":["Uhlmann, Mareike"],"dc:description.abstract":["Die protonenpumpende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) koppelt den Transfer der Elektronen des NADH über ein Flavinmononukleotid und neun Eisen-Schwefel (Fe/S)-Zentren auf ein Chinon mit der Translokation von vier Protonen über die Membran. Aufgrund fehlender Strukturdaten und seines komplexen Aufbaus ist der Mechanismus noch nicht verstanden. Der Komplex I aus dem Bakterium Escherichia coli besteht aus 13 verschiedenen Untereinheiten NuoA bis NuoN, die von den Genen des 15 kbp großen nuo-Operons kodiert werden. Die Gene nuoC und nuoD sind in E. coli zu einem Gen fusioniert.
Das nuo-Operon wurde in den Expressionvektor pBAD33 kloniert und die nuo-Gene extrachromosomal exprimiert. Dies führte zu der Produktion eines funktionellen Komplex I. Es wurden Subklone der Gene nuoA bis nuoM´ hergestellt, die mittels PCR mutiert und in den Expressionsvektor rückkloniert werden sollten. Dies war aufgrund fehlender Zwischenvektoren nur für die Gene nuoA bis nuoE´ möglich. Die Mutationen auf den übrigen Genen wurden über die sogenannte l-Red vermittelte Rekombination in das Expressionsplasmid eingefügt.
Die Untereinheiten NuoB, NuoC und NuoF wurden jeweils C-terminal mit einem Affinitäts-Peptid modifiziert, um den Komplex über eine Affinitätschromatographie aufzureinigen. Dieses Peptid verhinderte die Assemblierung, destabilisierte den Komplex oder wurde nicht von dem Säulenmaterial gebunden. Für eine schnelle und effiziente Aufreinigung des Komplexes muß das Peptid an andere Untereinheiten fusioniert werden. Die Deletion der Gene nuoCD, nuoG, nuoM und der Gengruppe nuoE bis nuoF verhinderte jeweils die Assemblierung des Komplex I. Das Cytosol der DnuoCD Mutante enthielt ein lösliches Fragment des Komplexes. Weitere Deletionen werden zeigen, welche Gene für die Assemblierung dieses Fragmentes benötigt werden.
Die Cysteine eines zusätzlichen Bindemotivs für ein Fe/S-Zentrum auf der Untereinheit NuoG wurden gegen Alanine ausgetauscht. Die ESR-spektroskopische Charakterisierung der mutierten Proteine zeigte, dass das ESR-Signal, das diesem Motiv zugeordnet wurde, von einem Zentrum der Untereinheit NuoE stammt. Da die Mutationen die Assemblierung störten, bindet das zusätzliche Bindemotiv auf NuoG wahrscheinlich ein bislang nicht nachgewiesenes Fe/S-Zentrum.","The proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) couples the transfer of electrons from NADH over a flavine mononucleotide and up to nine iron-sulfur (Fe/S) clusters to quinone with the translocation of protons across the membrane. Because of missing structural data and of the high complexity of the enzyme its mechanism isn´t known yet. Complex I from the bacterium Escherichia coli consists of 13 subunits NuoA to NuoN that are encoded by the genes of the 15 kbp big nuo-operon. In E. coli the genes nuoC and nuoD are fused to one gene nuoCD.
The nuo-operon was cloned in the expression vector pBAD33 and the nuo-genes were expressed extrachromosomally. This led to the production of a functional complex I. Subclones of the genes nuoA to nuoM´ were made. This clones should be mutated based on PCR methods and thereupon cloned back in the expression vector. Because of missing shuttle clones this was only possible for the genes nuoA to nuoE´. Mutations in other genes were inserted into the expression plasmid by means of l-Red mediated recombination.
Subunits NuoB, NuoC and NuoF were modificated with a C-terminal affinity peptide to purify the complex through affinity chromatography. This peptide inhibited assembly, destabilized the complex or could not be bound to the gel matrix. For quick and efficient purification of the complex the peptide must be bound to other subunits. Deletion of genes nuoCD, nuoG, nuoM and the gene group nuoE to F disturbed in each case assembly of complex I. Cytoplasma of the DnuoCD mutant contained a soluble fragment of the complex. Further deletions will show which genes are required for assembly of this fragment.
Cysteines of an additional binding motif for a Fe/S cluster were changed to alanines. EPR spectroscopic characterization of the mutant proteins showed that the EPR signal assigned to this motif stems from a cluster on subunit NuoE. Because the assembly of the complex is disturbed by the mutations this motif on NuoG binds probably a so far not detected Fe/S cluster."],"dc:format.medium":["application/pdf"],"dc:subject":["Lambda-Red vermittelte Rekombination","NADH:Ubichinon Oxidoreduktase","Lambda-Red mediated recombination","NADH:ubiquinone oxidoreductase"],"dc:title":["Mutagenese des nuo-Operons von Escherichia coli","Mutagenesis of the nuo-operon from Escherichia coli"],"dc:type":["DoctoralThesis"]},"updated_at":"2026-07-24T02:22:28Z"}