Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. als Bioreaktor : quantitative Promotoranalyse und Produktion eines komplexen humanen Blutgerinnungsfaktors

Die vorliegende Arbeit diente der Etablierung von Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. als System zur Produktion rekombinanter Proteinpharmazeutika. <br>Um ein Produktionssystem für heterologe Proteine flexibel nutzen zu können, ist es notwendig, die Expressionseffizienz der Transgene zu regulieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 19 Expressionsvektoren erstellt, mit denen quantitative Aktivitätsstudien an sieben heterologen und zwei endogenen Promotoren unter Verwendung eines dualen Luciferase-Reportersystems durchgeführt wurden. Zu den analysierten heterologen Promotoren zählten zum einen solche, die in der Regel eine recht hohe Effizienz in Pflanzen zeigen wie der CaMV 35S-Promotor, der Reis-Aktin- und der NOS-Promotor. Zum anderen wurden Promotoren getestet, welche gewöhnlich für die Expression von Transgenen in tierischen Zellen Verwendung finden wie der CMV- und der SV40-Promotor. Zur Bestimmung der Aktivität endogener Promotoren in Physcomitrella wurden die 5'-Bereiche zweier mooseigener Glykosyltransferasen mittels inverser PCR identifiziert. Es wurden 2087 bp des 5'-Bereiches der alpha-1,3-Fucosyl- (FucT) und 1430 bp der beta-1,2-Xylosyltransferase (XylT) isoliert. Neben der Quantifizierung der Promotoraktivität erfolgte eine computergestützte Analyse sowie eine über jeweils vier Deletionskonstrukte ermittelte funktionelle Charakterisierung der 5'-Sequenzen. Aus den durchgeführten Analysen geht hervor, dass in Physcomitrella patens Promotoren zur Verfügung stehen, welche Expressionseffizienzen vermitteln, die drei Größenordungen umfassen. Die Untersuchung der endogenen Promotorbereiche zeigte zudem, dass die 5'-FucT- und die 5'-XylT-Sequenz als sinnvolle Alternativen zu heterologen Sequenzen eingesetzt werden können. <br>Der humane Blutgerinnungsfaktor IX wurde als Modellprotein zur Optimierung von Physcomitrella patens als Produktionsplattform für komplexe rekombinante Proteine ausgewählt. Um die Produktion eines biologisch aktiven Faktor IX zu gewährleisten, sind stabile transgene Pflanzen erforderlich, die neben der codierenden Sequenz von Faktor IX auch die Sequenzen der beiden essentiellen aber nicht im Physcomitrella-Wildtyp vorkommenden Enzyme, der GGC (Gamma-Glutamyl-Carboxylase) sowie der PACE (paired basic amino acid cleaving enzyme), enthalten. Die zur Transformation eingesetzten Expressionsvektoren wurden so konzipiert, dass eine homologe Integration der GGC- sowie der PACE-Sequenz in die Genorte der alpha-1,3-Fucosyl- bzw. der beta-1,2-Xylosyltransferase zum Verlust pflanzenspezifischer Glykane führte, für die ein allergenes Potenzial nachgewiesen wurde. Von 155 selektierten Pflanzen, bei denen Transgene identifiziert wurden, enthielten 26 Pflanzen zwei Transgene, davon 21 die GGC- sowie die PACE-Sequenz. Bei 40 Pflanzen wurden alle drei Transgene detektiert, was einem Anteil von 25,8 % entspricht. Die selektierten Pflanzen wurden sowohl auf molekulargenetischer als auch auf biochemischer Ebene charakterisiert. Insgesamt wurden hierdurch elf stabile transgene Pflanzen identifiziert, welche alle drei essentiellen Gene exprimieren und bei denen zudem das beta-1,2 Xylosyltransferasegen inaktiviert wurde. <br>Mit Hilfe der erzeugten Pflanzen wurde die Herstellung des humanen Blutgerinnungsfaktor IX in dem Moos Physcomitrella patens ermöglicht und folglich die Eignung des Mooses als Produktionssystem für komplexe rekombinante Proteine unter Beweis gestellt. Die gezielte Ausschaltung der beta-1,2-Xylosyltransferase stellt in diesem Zusammenhang einen bedeutenden Schritt im Hinblick auf die Humanisierung des Glykosylierungsmusters dar.

Author dc:creator

• Horstmann, Verena

Contributors dc:contributor

• Reski, Ralf

• molecular farming
• duales Luciferase-Reportersystem
• Promotoranalyse
• Faktor IX
• moss, promoter analysis
• haemophilia B
• factor IX

Repository record source_url

https://freidok.uni-freiburg.de/data/1684

OAI identifier oai:identifier

oai:freidok.uni-freiburg.de:1684