{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1684"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1684","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. als Bioreaktor : quantitative Promotoranalyse und Produktion eines komplexen humanen Blutgerinnungsfaktors","abstract":"Die vorliegende Arbeit diente der Etablierung von Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. als System zur Produktion rekombinanter Proteinpharmazeutika.
Um ein Produktionssystem für heterologe Proteine flexibel nutzen zu können, ist es notwendig, die Expressionseffizienz der Transgene zu regulieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 19 Expressionsvektoren erstellt, mit denen quantitative Aktivitätsstudien an sieben heterologen und zwei endogenen Promotoren unter Verwendung eines dualen Luciferase-Reportersystems durchgeführt wurden. Zu den analysierten heterologen Promotoren zählten zum einen solche, die in der Regel eine recht hohe Effizienz in Pflanzen zeigen wie der CaMV 35S-Promotor, der Reis-Aktin- und der NOS-Promotor. Zum anderen wurden Promotoren getestet, welche gewöhnlich für die Expression von Transgenen in tierischen Zellen Verwendung finden wie der CMV- und der SV40-Promotor. Zur Bestimmung der Aktivität endogener Promotoren in Physcomitrella wurden die 5'-Bereiche zweier mooseigener Glykosyltransferasen mittels inverser PCR identifiziert. Es wurden 2087 bp des 5'-Bereiches der alpha-1,3-Fucosyl- (FucT) und 1430 bp der beta-1,2-Xylosyltransferase (XylT) isoliert. Neben der Quantifizierung der Promotoraktivität erfolgte eine computergestützte Analyse sowie eine über jeweils vier Deletionskonstrukte ermittelte funktionelle Charakterisierung der 5'-Sequenzen. Aus den durchgeführten Analysen geht hervor, dass in Physcomitrella patens Promotoren zur Verfügung stehen, welche Expressionseffizienzen vermitteln, die drei Größenordungen umfassen. Die Untersuchung der endogenen Promotorbereiche zeigte zudem, dass die 5'-FucT- und die 5'-XylT-Sequenz als sinnvolle Alternativen zu heterologen Sequenzen eingesetzt werden können.
Der humane Blutgerinnungsfaktor IX wurde als Modellprotein zur Optimierung von Physcomitrella patens als Produktionsplattform für komplexe rekombinante Proteine ausgewählt. Um die Produktion eines biologisch aktiven Faktor IX zu gewährleisten, sind stabile transgene Pflanzen erforderlich, die neben der codierenden Sequenz von Faktor IX auch die Sequenzen der beiden essentiellen aber nicht im Physcomitrella-Wildtyp vorkommenden Enzyme, der GGC (Gamma-Glutamyl-Carboxylase) sowie der PACE (paired basic amino acid cleaving enzyme), enthalten. Die zur Transformation eingesetzten Expressionsvektoren wurden so konzipiert, dass eine homologe Integration der GGC- sowie der PACE-Sequenz in die Genorte der alpha-1,3-Fucosyl- bzw. der beta-1,2-Xylosyltransferase zum Verlust pflanzenspezifischer Glykane führte, für die ein allergenes Potenzial nachgewiesen wurde. Von 155 selektierten Pflanzen, bei denen Transgene identifiziert wurden, enthielten 26 Pflanzen zwei Transgene, davon 21 die GGC- sowie die PACE-Sequenz. Bei 40 Pflanzen wurden alle drei Transgene detektiert, was einem Anteil von 25,8 % entspricht. Die selektierten Pflanzen wurden sowohl auf molekulargenetischer als auch auf biochemischer Ebene charakterisiert. Insgesamt wurden hierdurch elf stabile transgene Pflanzen identifiziert, welche alle drei essentiellen Gene exprimieren und bei denen zudem das beta-1,2 Xylosyltransferasegen inaktiviert wurde.
Mit Hilfe der erzeugten Pflanzen wurde die Herstellung des humanen Blutgerinnungsfaktor IX in dem Moos Physcomitrella patens ermöglicht und folglich die Eignung des Mooses als Produktionssystem für komplexe rekombinante Proteine unter Beweis gestellt. Die gezielte Ausschaltung der beta-1,2-Xylosyltransferase stellt in diesem Zusammenhang einen bedeutenden Schritt im Hinblick auf die Humanisierung des Glykosylierungsmusters dar.","abstract_html":"Die vorliegende Arbeit diente der Etablierung von Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. als System zur Produktion rekombinanter Proteinpharmazeutika. <br>Um ein Produktionssystem für heterologe Proteine flexibel nutzen zu können, ist es notwendig, die Expressionseffizienz der Transgene zu regulieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 19 Expressionsvektoren erstellt, mit denen quantitative Aktivitätsstudien an sieben heterologen und zwei endogenen Promotoren unter Verwendung eines dualen Luciferase-Reportersystems durchgeführt wurden. Zu den analysierten heterologen Promotoren zählten zum einen solche, die in der Regel eine recht hohe Effizienz in Pflanzen zeigen wie der CaMV 35S-Promotor, der Reis-Aktin- und der NOS-Promotor. Zum anderen wurden Promotoren getestet, welche gewöhnlich für die Expression von Transgenen in tierischen Zellen Verwendung finden wie der CMV- und der SV40-Promotor. Zur Bestimmung der Aktivität endogener Promotoren in Physcomitrella wurden die 5'-Bereiche zweier mooseigener Glykosyltransferasen mittels inverser PCR identifiziert. Es wurden 2087 bp des 5'-Bereiches der alpha-1,3-Fucosyl- (FucT) und 1430 bp der beta-1,2-Xylosyltransferase (XylT) isoliert. Neben der Quantifizierung der Promotoraktivität erfolgte eine computergestützte Analyse sowie eine über jeweils vier Deletionskonstrukte ermittelte funktionelle Charakterisierung der 5'-Sequenzen. Aus den durchgeführten Analysen geht hervor, dass in Physcomitrella patens Promotoren zur Verfügung stehen, welche Expressionseffizienzen vermitteln, die drei Größenordungen umfassen. Die Untersuchung der endogenen Promotorbereiche zeigte zudem, dass die 5'-FucT- und die 5'-XylT-Sequenz als sinnvolle Alternativen zu heterologen Sequenzen eingesetzt werden können. <br>Der humane Blutgerinnungsfaktor IX wurde als Modellprotein zur Optimierung von Physcomitrella patens als Produktionsplattform für komplexe rekombinante Proteine ausgewählt. Um die Produktion eines biologisch aktiven Faktor IX zu gewährleisten, sind stabile transgene Pflanzen erforderlich, die neben der codierenden Sequenz von Faktor IX auch die Sequenzen der beiden essentiellen aber nicht im Physcomitrella-Wildtyp vorkommenden Enzyme, der GGC (Gamma-Glutamyl-Carboxylase) sowie der PACE (paired basic amino acid cleaving enzyme), enthalten. Die zur Transformation eingesetzten Expressionsvektoren wurden so konzipiert, dass eine homologe Integration der GGC- sowie der PACE-Sequenz in die Genorte der alpha-1,3-Fucosyl- bzw. der beta-1,2-Xylosyltransferase zum Verlust pflanzenspezifischer Glykane führte, für die ein allergenes Potenzial nachgewiesen wurde. Von 155 selektierten Pflanzen, bei denen Transgene identifiziert wurden, enthielten 26 Pflanzen zwei Transgene, davon 21 die GGC- sowie die PACE-Sequenz. Bei 40 Pflanzen wurden alle drei Transgene detektiert, was einem Anteil von 25,8 % entspricht. Die selektierten Pflanzen wurden sowohl auf molekulargenetischer als auch auf biochemischer Ebene charakterisiert. Insgesamt wurden hierdurch elf stabile transgene Pflanzen identifiziert, welche alle drei essentiellen Gene exprimieren und bei denen zudem das beta-1,2 Xylosyltransferasegen inaktiviert wurde. <br>Mit Hilfe der erzeugten Pflanzen wurde die Herstellung des humanen Blutgerinnungsfaktor IX in dem Moos Physcomitrella patens ermöglicht und folglich die Eignung des Mooses als Produktionssystem für komplexe rekombinante Proteine unter Beweis gestellt. 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Um ein Produktionssystem für heterologe Proteine flexibel nutzen zu können, ist es notwendig, die Expressionseffizienz der Transgene zu regulieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 19 Expressionsvektoren erstellt, mit denen quantitative Aktivitätsstudien an sieben heterologen und zwei endogenen Promotoren unter Verwendung eines dualen Luciferase-Reportersystems durchgeführt wurden. Zu den analysierten heterologen Promotoren zählten zum einen solche, die in der Regel eine recht hohe Effizienz in Pflanzen zeigen wie der CaMV 35S-Promotor, der Reis-Aktin- und der NOS-Promotor. Zum anderen wurden Promotoren getestet, welche gewöhnlich für die Expression von Transgenen in tierischen Zellen Verwendung finden wie der CMV- und der SV40-Promotor. Zur Bestimmung der Aktivität endogener Promotoren in Physcomitrella wurden die 5'-Bereiche zweier mooseigener Glykosyltransferasen mittels inverser PCR identifiziert. Es wurden 2087 bp des 5'-Bereiches der alpha-1,3-Fucosyl- (FucT) und 1430 bp der beta-1,2-Xylosyltransferase (XylT) isoliert. Neben der Quantifizierung der Promotoraktivität erfolgte eine computergestützte Analyse sowie eine über jeweils vier Deletionskonstrukte ermittelte funktionelle Charakterisierung der 5'-Sequenzen. Aus den durchgeführten Analysen geht hervor, dass in Physcomitrella patens Promotoren zur Verfügung stehen, welche Expressionseffizienzen vermitteln, die drei Größenordungen umfassen. Die Untersuchung der endogenen Promotorbereiche zeigte zudem, dass die 5'-FucT- und die 5'-XylT-Sequenz als sinnvolle Alternativen zu heterologen Sequenzen eingesetzt werden können.
Der humane Blutgerinnungsfaktor IX wurde als Modellprotein zur Optimierung von Physcomitrella patens als Produktionsplattform für komplexe rekombinante Proteine ausgewählt. Um die Produktion eines biologisch aktiven Faktor IX zu gewährleisten, sind stabile transgene Pflanzen erforderlich, die neben der codierenden Sequenz von Faktor IX auch die Sequenzen der beiden essentiellen aber nicht im Physcomitrella-Wildtyp vorkommenden Enzyme, der GGC (Gamma-Glutamyl-Carboxylase) sowie der PACE (paired basic amino acid cleaving enzyme), enthalten. Die zur Transformation eingesetzten Expressionsvektoren wurden so konzipiert, dass eine homologe Integration der GGC- sowie der PACE-Sequenz in die Genorte der alpha-1,3-Fucosyl- bzw. der beta-1,2-Xylosyltransferase zum Verlust pflanzenspezifischer Glykane führte, für die ein allergenes Potenzial nachgewiesen wurde. Von 155 selektierten Pflanzen, bei denen Transgene identifiziert wurden, enthielten 26 Pflanzen zwei Transgene, davon 21 die GGC- sowie die PACE-Sequenz. Bei 40 Pflanzen wurden alle drei Transgene detektiert, was einem Anteil von 25,8 % entspricht. Die selektierten Pflanzen wurden sowohl auf molekulargenetischer als auch auf biochemischer Ebene charakterisiert. Insgesamt wurden hierdurch elf stabile transgene Pflanzen identifiziert, welche alle drei essentiellen Gene exprimieren und bei denen zudem das beta-1,2 Xylosyltransferasegen inaktiviert wurde.
Mit Hilfe der erzeugten Pflanzen wurde die Herstellung des humanen Blutgerinnungsfaktor IX in dem Moos Physcomitrella patens ermöglicht und folglich die Eignung des Mooses als Produktionssystem für komplexe rekombinante Proteine unter Beweis gestellt. Die gezielte Ausschaltung der beta-1,2-Xylosyltransferase stellt in diesem Zusammenhang einen bedeutenden Schritt im Hinblick auf die Humanisierung des Glykosylierungsmusters dar.","The aim of the thesis is the establishment of the moss Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. as a production system for recombinant, pharmaceutically relevant proteins.
For the flexible usage of a production system it is important to regulate the expression efficiencies of the transgenes. Within the context of this work 19 expression vectors were created for the quantitative analysis of seven heterologous and two endogenous promoters using the Dual-Luciferase Reporter Assay System. Promoters were analysed which generally show quite high expression levels in plants, for example three versions of the CaMV 35S promoter, the rice actin-1 gene promoter and the NOS promoter. The activities of promoters, which are usually used for gene expression in mammalian systems were also determined, such as the CMV and the SV40 promoter. The 5'-regions of two endogenous glycosyltransferases, 2078 bp of the alpha-1,3-fucosyl- and 1430 bp of the beta-1,2-xylosyltransferase, were identified via inverse PCR. Their promoter activities were determined and they were functionally characterised by the use of computer supported analysis and by the examination of four deletion constructs in each case. The performed investigations showed that in Physcomitrella patens there are promoters available which drive expression efficiencies encompassing three orders of magnitude.
The human blood coagulation factor IX was chosen as a model protein for the utilisation of Physcomitrella patens as a production system of heterologous proteins. To assure the expression of biologically active factor IX, stable transgenic plants were generated by targeted insertion of necessary gene sequences, i.e. the coding sequences of factor IX and two essential posttranslational modifying enzymes (GGC: gamma-glutamyl-carboxylase; PACE: paired basic amino acid cleaving enzyme). Simultaneously, the presence of two plant-specific glycans, which are supposed to posses allergenic potential, should be prevented due to integration by homologous recombination. The selected plants were characterised at the molecular and biochemical level. Out of 155 selected plants, eleven plants were identified which express the three essential genes and in which the xylosyltransferase gene is deactivated."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. als Bioreaktor : quantitative Promotoranalyse und Produktion eines komplexen humanen Blutgerinnungsfaktors","Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. as bioreactor : quantitative promoter analysis and production of a complex human coagulation factor"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Reski, Ralf"],"dc:creator":["Horstmann, Verena"],"dc:description.abstract":["Die vorliegende Arbeit diente der Etablierung von Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. als System zur Produktion rekombinanter Proteinpharmazeutika.
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Der humane Blutgerinnungsfaktor IX wurde als Modellprotein zur Optimierung von Physcomitrella patens als Produktionsplattform für komplexe rekombinante Proteine ausgewählt. Um die Produktion eines biologisch aktiven Faktor IX zu gewährleisten, sind stabile transgene Pflanzen erforderlich, die neben der codierenden Sequenz von Faktor IX auch die Sequenzen der beiden essentiellen aber nicht im Physcomitrella-Wildtyp vorkommenden Enzyme, der GGC (Gamma-Glutamyl-Carboxylase) sowie der PACE (paired basic amino acid cleaving enzyme), enthalten. Die zur Transformation eingesetzten Expressionsvektoren wurden so konzipiert, dass eine homologe Integration der GGC- sowie der PACE-Sequenz in die Genorte der alpha-1,3-Fucosyl- bzw. der beta-1,2-Xylosyltransferase zum Verlust pflanzenspezifischer Glykane führte, für die ein allergenes Potenzial nachgewiesen wurde. Von 155 selektierten Pflanzen, bei denen Transgene identifiziert wurden, enthielten 26 Pflanzen zwei Transgene, davon 21 die GGC- sowie die PACE-Sequenz. Bei 40 Pflanzen wurden alle drei Transgene detektiert, was einem Anteil von 25,8 % entspricht. Die selektierten Pflanzen wurden sowohl auf molekulargenetischer als auch auf biochemischer Ebene charakterisiert. Insgesamt wurden hierdurch elf stabile transgene Pflanzen identifiziert, welche alle drei essentiellen Gene exprimieren und bei denen zudem das beta-1,2 Xylosyltransferasegen inaktiviert wurde.
Mit Hilfe der erzeugten Pflanzen wurde die Herstellung des humanen Blutgerinnungsfaktor IX in dem Moos Physcomitrella patens ermöglicht und folglich die Eignung des Mooses als Produktionssystem für komplexe rekombinante Proteine unter Beweis gestellt. Die gezielte Ausschaltung der beta-1,2-Xylosyltransferase stellt in diesem Zusammenhang einen bedeutenden Schritt im Hinblick auf die Humanisierung des Glykosylierungsmusters dar.","The aim of the thesis is the establishment of the moss Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. as a production system for recombinant, pharmaceutically relevant proteins.
For the flexible usage of a production system it is important to regulate the expression efficiencies of the transgenes. Within the context of this work 19 expression vectors were created for the quantitative analysis of seven heterologous and two endogenous promoters using the Dual-Luciferase Reporter Assay System. Promoters were analysed which generally show quite high expression levels in plants, for example three versions of the CaMV 35S promoter, the rice actin-1 gene promoter and the NOS promoter. The activities of promoters, which are usually used for gene expression in mammalian systems were also determined, such as the CMV and the SV40 promoter. The 5'-regions of two endogenous glycosyltransferases, 2078 bp of the alpha-1,3-fucosyl- and 1430 bp of the beta-1,2-xylosyltransferase, were identified via inverse PCR. Their promoter activities were determined and they were functionally characterised by the use of computer supported analysis and by the examination of four deletion constructs in each case. The performed investigations showed that in Physcomitrella patens there are promoters available which drive expression efficiencies encompassing three orders of magnitude.
The human blood coagulation factor IX was chosen as a model protein for the utilisation of Physcomitrella patens as a production system of heterologous proteins. To assure the expression of biologically active factor IX, stable transgenic plants were generated by targeted insertion of necessary gene sequences, i.e. the coding sequences of factor IX and two essential posttranslational modifying enzymes (GGC: gamma-glutamyl-carboxylase; PACE: paired basic amino acid cleaving enzyme). Simultaneously, the presence of two plant-specific glycans, which are supposed to posses allergenic potential, should be prevented due to integration by homologous recombination. The selected plants were characterised at the molecular and biochemical level. Out of 155 selected plants, eleven plants were identified which express the three essential genes and in which the xylosyltransferase gene is deactivated."],"dc:format.medium":["application/pdf"],"dc:subject":["molecular farming","duales Luciferase-Reportersystem","Promotoranalyse","Faktor IX","moss, promoter analysis","haemophilia B","factor IX"],"dc:title":["Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. als Bioreaktor : quantitative Promotoranalyse und Produktion eines komplexen humanen Blutgerinnungsfaktors","Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. as bioreactor : quantitative promoter analysis and production of a complex human coagulation factor"],"dc:type":["DoctoralThesis"]},"updated_at":"2026-07-24T02:22:22Z"}