Erforschung des Beitrags des MAPK- und STAT-Signalwegs an der EGF-vermittelten Aktivierung der c-fos-Gen-Expression

Das c-fos-Gen enthält eine Vielzahl regulatorischer DNA-Bindestellen in seiner Promotor-Region. Diese Promotor-Elemente sind entscheidend an der spezifischen Antwort zu verschiedenen Umweltreizen, denen Zellen im Körper ausgesetzt sind, beteiligt. Die Stärke der c-fos-Gen-Expression ist abhängig von den, in der Promotor-Region-gebundenen Transkriptionsfaktoren und der Interaktion mit anderen Faktoren im Zellkern. Die Fehlregulation dieses Gens ist mit der Entstehung von Knochenkrebs korreliert. Ein bekannter Stimulus der c-fos-Gen-Expression ist die Gabe von Epidermis-Wachstumsfaktor. Dieser bindet an den EGF-Rezeptor und durch diese Interaktion wird der äußere Reiz über verschiedene Signalwege in die Zelle übermittelt und in eine entsprechende Gen-Aktivierung umgesetzt. Der EGF-Rezeptor und das verwandte EGF-Rezeptor-Familien-Mitglied, der ErbB2-Rezeptor, werden in vielen verschiedenen Krebsarten überexprimiert oder zeigen häufig Aminosäure-Substitutionen, deren Bedeutung in der Tumorgenese durch epidemiologische Studien untermauert wurden. <br>In dieser Arbeit waren der Mitogen-Aktivierte-Protein-Kinase- (MAPK)- und der Signal-Transduzierer-und-Aktivatoren-der-Transkription-(STAT)-vermittelte Signal-weg von zentralem Interesse. Zu Beginn der Entdeckung von STAT-Proteinen wurde angenommen, dass diese lediglich durch Zytokine aktiviert wurden. Es zeigte sich jedoch später, dass auch Wachstumsfaktoren ihre Aktivierung verursachen konnten. Da es sich bei dem EGF-Rezeptor um ein Transmembran-Protein handelte, im Gegensatz zu den aus mehreren Untereinheiten-bestehenden Zytokin-Rezeptoren, wurde der EGF-Rezeptor als Modellbeispiel zur Untersuchung dieses Signalwegs gewählt. Die Untersuchungen wurden in immortalisierten, in Zellkultur-gehaltenen Zellen mit transfizierten Plasmiden, auf denen Reporter-Gene kodiert wurden und deren Expression über Promotorelemente des c-fos-Promotors gesteuert wurden, ausgeführt. Es war von Interesse, inwiefern Komponenten dieser beiden Signalwege miteinander in der EGF-vermittelten Reporter-Gen-Expression ko-operierten. Ich habe den Beitrag der durch diese beiden Signalwege nach EGF-Gabe aktivierten Transkriptionsfaktoren an der Expression von Reporter-Genen detailliert erforscht und konnte folgende Schlüsse ziehen: <br>-Faktoren, die an eine STAT-Bindestelle binden ko-operieren in der Aktivierung der Reporter-Gen-Expression nach Gabe von EGF mit Faktoren, die an eine SRE-Bindestelle binden. <br>- Das Ausmass der beobachteten Aktivierung der Reporter-Gen-Expression nach Gabe von EGF ist abhängig vom Abstand zwischen der STAT- und SRE-Bindestelle. Dies wurde schlüssig durch Verwenden verschiedener Reporter-Gen-Konstrukte gezeigt. Für diese wurden die STAT- und die SRE-Bindestelle in verschiedenen Abständen voneinander, aber im selben Abstand von der TATA-Box, in die Promotor-Region des Reporter-Gens kloniert. <br>-Der beobachtete synergistische Effekt, den Faktoren, die an die STAT-Bindestelle und an die SRE-Bindestelle in der Promotor-Region der Reporter-Gene binden, vermitteln ist nicht offensichtlich abhängig von der Orientierung der Bindestellen auf der DNA-Helix. <br>- Die Sequenz zwischen der STAT- und der SRE-Bindestelle hat keinen Einfluss in dem benutzten Reporter-System auf die EGF-vermittelte Aktivierung der Reporter-Gen-Aktivität. <br>- Es gibt keinen Unterschied in dem verwendeten Reporter-System bezüglich der EGF-vermittelten Aktivierung der Reporter-Gen-Aktivität beim Vergleich einer im c-fos-Promotor enthaltenen STAT-Bindestelle mit einer mutierten STAT-Bindestelle, die in Gel-elektrophoretischen Mobilitäts-Analysen eine erhöhte STAT-Binde-Affinität zeigt. <br>- Hingegen ermöglichten A431-Zellextrakte von unbehandelten oder induzierten Zellen zumindest zum Teil die Charakterisierung der Proteinkomplexe, die sich in der Promotor-Region des Reporter-Gens ausbilden, bei dem die STAT- und die SRE-Bindestelle einen Abstand von 9 bp haben. In diesem Fall konnte eindeutig gezeigt werden, dass STAT- und TCF-Proteine in ihrer Beteiligung am gebildeten Multi-Protein-Komplex auf dem Promotor konkurrieren. Vermutlich können beide aus sterischen Gründen nicht binden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass diese Konkurrenz bei einem Promotor, in dem die STAT- und die SRE-Bindestelle 18 bp auseinander liegen, nicht besteht.

Author dc:creator

• Kindle, Karin

Contributors dc:contributor

• Sippel, Albrecht E.

• c-fos
• epidermal growth factor
• gene expression
• sis-inducible element
• serum response element

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