In vitro Untersuchungen zum Translationsarrest in Escherichia coli

Die Zielsteuerung von sekretorischen Proteinen und Membranproteinen erfolgt in Eukaryonten und Prokaryonten durch eine evolutionär konservierte Proteinmaschinerie. Ein wesentlicher Ribonuklein-Proteinkomplex, welcher das Targeting von sekretorischen Proteinen und Membranproteinen in der Säugetierzelle wahrnimmt, ist der Signal Recognition Particle (SRP). Dieser bindet an die Signalsequenz gerade entstehender Proteine, unterbricht deren Translation und steuert das Ribosom mit der naszierenden Proteinkette zur Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER). Die Interaktion des SRP mit seinem Rezeptor an der ER-Membran löst den Translationsarrest auf. Das Protein wird daraufhin fertiggestellt und zugleich entweder in die Membran integriert oder über diese transloziert. Der Translationsarrest soll bewirken, dass die zu transportierenden Proteine nicht fertig gestellt werden bevor sie den Zielort erreichen, da lange Proteinketten im Zytoplasma falten und damit nicht mehr translokations-/integrationskompetent sind. In der Bakterienzelle existiert ein strukturell deutlich verschiedenes SRP-Homolog, welches die Integration von Membranproteinen steuert. Homologien zu den Domänen des eukaryotischen SRP, welche den Translationsarrest vermitteln, enthält es nicht. Ob es trotzdem in der prokaryotischen Zelle zu einem SRP-vermittelten Translationsarrest kommt, war die wesentliche Fragestellung dieser Arbeit. Im Rahmen der Untersuchungen wurden verschiedene bakterielle Membranproteine in einem In-vitro Syntheseansatz exprimiert. Es fand sich eine konsistente Hemmung der Synthese, wenn dem Ansatz bakterielles SRP zugegeben wurde. Um die Spezifität des Effekts für Membranproteine herauszuarbeiten, wurden ein zytosolisches und ein sekretorisches Protein untersucht, wobei keine Hemmung der Synthese durch bakterielles SRP stattfand. Des Weiteren schien der Effekt von einem funktionellen SRP, bestehend aus Ffh und 4.5S RNA, abhängig zu sein, da ohne die RNA-Komponente keine Translationsarretierung festzustellen war. Ein weiterer Hinweis für die Spezifität des Phänomens war die Auflösbarkeit des Hemmeffektes durch Zugabe von Membranvesikeln, die offenbar bewirkten, dass das bakterielle SRP mit seinem Membranrezeptor interagierte und damit die arretierten Proteine fertiggestellt wurden. Die Synthese von ribosomenassoziierten naszierenden Ketten (RNC) verschiedener Länge ergab ähnliche Resultate, die vor allem im Sinne einer vorübergehenden Translationsverzögerung interpretiert werden konnten. Angesichts dieser Resultate scheint SRP auch in E.coli einen Translationsarrest auszulösen.

Author dc:creator

• Binder, Mascha

Contributors dc:contributor

• Müller, Matthias

• Translationsarrest
• 4.5S RNA
• translational arrest
• signal recognition particle

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