Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferase CDTa von Clostridium difficile

Clostridium difficile ist der häufigste Erreger der Antibiotika-assoziierten Diarrhö und der pseudomembranösen Kolitis. Der Keim produziert neben zwei Proteintoxinen (Toxin A und B), die bislang als die entscheidenden Pathogenitätsfaktoren angesehen werden, ein weiteres Exotoxin, die C. difficile Transferase (CDT). Dabei handelt es sich um eine binär aufgebaute ADP-Ribosyltransferase, die mit den binären Toxinen von C. botulinum (C2-Toxin) und C. perfringens (Iota-Toxin) verwandt ist. Die Transferase besteht aus der Enzymkomponente CDTa (48 kDa) und der Binde- und Transportkomponente CDTb (94 kDa). CDTa ADP-ribosyliert monomeres G-Aktin und führt so zu einer Hemmung der Aktinpolymerisation und zum Zusammenbruch des Aktin-Zytoskeletts. <br>In der vorliegenden Arbeit wurde eine Struktur-Funktions-Analyse der Enzymkomponente CDTa durchgeführt. Zunächst wurde die Substratspezifität von CDTa untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das ADP-ribosylierende Toxin von C. difficile sowohl zelluläres &#61538;&#61487;&#61543;-Aktin als auch &#61537;-Skelettmuskelaktin modifiziert und somit dieselbe Substratspezifität wie Iota-Toxin besitzt. <br>Das katalytische Zentrum der Enzymkomponente wurde mittels zielgerichteter Mutagenese identifiziert. Der Austausch der Glutamatreste an Position 428 und 430 gegen Glutamin verursachte den vollständigen Verlust der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität von CDTa. Der Austausch von Serin-388 gegen Alanin sowie von Arginin-345 gegen Lysin führte ebenfalls zu einer deutlichen Verminderung der Enzymaktivität. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es sich bei Glutamat-430 um das in allen ADP-Ribosyltransferasen konservierte „katalytische“ Glutamat handelt. Mit Glutamat-428, Serin-388 und Arginin-345 wurden weitere, für die Funktion von CDTa essentielle, Aminosäuren identifiziert. <br>Da ein N-terminal verkürztes Fragment der C. difficile Transferase, CDTa244-463, eine deutlich verminderte ADP-Ribosyltransferase-Aktivität verglichen mit dem Holotoxin CDTa aufwies, ist zu vermuten, dass die enzymatische Domäne des C-Terminus von CDTa seinen N-Terminus zur korrekten Faltung und/oder Stabilisierung benötigt. <br>Im Rahmen der Arbeit wurde weiterhin ein chimäres Toxin aus CDTa1-240 und der ADP-Ribosyltransferase C3lim konstruiert. Versuche mit diesem Fusionsprotein deuten darauf hin, dass der N-terminale Teil von CDTa (Aminosäuren 1-240) eine Adapterfunktion für die Interaktion mit der Bindekomponente besitzt. In Anwesenheit der Bindekomponente des Iota-Toxins wurde das chimäre Toxin CDTa1-240-C3lim in Vero-Zellen aufgenommen und führte, wahrscheinlich durch eine ADP-Ribosylierung des C3lim Substrats Rho, zu einer Abrundung der Zellen.

Author dc:creator

• Gülke, Irene Sophie

Contributors dc:contributor

• Aktories, Klaus

• ADP-Ribosylierung
• Clostridium difficile
• Bakterielle Toxine
• Aktin
• ADP-ribosylation
• bacterial toxins
• actin

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