{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1502"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1502","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferase CDTa von Clostridium difficile","abstract":"Clostridium difficile ist der häufigste Erreger der Antibiotika-assoziierten Diarrhö und der pseudomembranösen Kolitis. Der Keim produziert neben zwei Proteintoxinen (Toxin A und B), die bislang als die entscheidenden Pathogenitätsfaktoren angesehen werden, ein weiteres Exotoxin, die C. difficile Transferase (CDT). Dabei handelt es sich um eine binär aufgebaute ADP-Ribosyltransferase, die mit den binären Toxinen von C. botulinum (C2-Toxin) und C. perfringens (Iota-Toxin) verwandt ist. Die Transferase besteht aus der Enzymkomponente CDTa (48 kDa) und der Binde- und Transportkomponente CDTb (94 kDa). CDTa ADP-ribosyliert monomeres G-Aktin und führt so zu einer Hemmung der Aktinpolymerisation und zum Zusammenbruch des Aktin-Zytoskeletts.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine Struktur-Funktions-Analyse der Enzymkomponente CDTa durchgeführt. Zunächst wurde die Substratspezifität von CDTa untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das ADP-ribosylierende Toxin von C. difficile sowohl zelluläres -Aktin als auch -Skelettmuskelaktin modifiziert und somit dieselbe Substratspezifität wie Iota-Toxin besitzt.
Das katalytische Zentrum der Enzymkomponente wurde mittels zielgerichteter Mutagenese identifiziert. Der Austausch der Glutamatreste an Position 428 und 430 gegen Glutamin verursachte den vollständigen Verlust der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität von CDTa. Der Austausch von Serin-388 gegen Alanin sowie von Arginin-345 gegen Lysin führte ebenfalls zu einer deutlichen Verminderung der Enzymaktivität. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es sich bei Glutamat-430 um das in allen ADP-Ribosyltransferasen konservierte „katalytische“ Glutamat handelt. Mit Glutamat-428, Serin-388 und Arginin-345 wurden weitere, für die Funktion von CDTa essentielle, Aminosäuren identifiziert.
Da ein N-terminal verkürztes Fragment der C. difficile Transferase, CDTa244-463, eine deutlich verminderte ADP-Ribosyltransferase-Aktivität verglichen mit dem Holotoxin CDTa aufwies, ist zu vermuten, dass die enzymatische Domäne des C-Terminus von CDTa seinen N-Terminus zur korrekten Faltung und/oder Stabilisierung benötigt.
Im Rahmen der Arbeit wurde weiterhin ein chimäres Toxin aus CDTa1-240 und der ADP-Ribosyltransferase C3lim konstruiert. Versuche mit diesem Fusionsprotein deuten darauf hin, dass der N-terminale Teil von CDTa (Aminosäuren 1-240) eine Adapterfunktion für die Interaktion mit der Bindekomponente besitzt. In Anwesenheit der Bindekomponente des Iota-Toxins wurde das chimäre Toxin CDTa1-240-C3lim in Vero-Zellen aufgenommen und führte, wahrscheinlich durch eine ADP-Ribosylierung des C3lim Substrats Rho, zu einer Abrundung der Zellen.","abstract_html":"Clostridium difficile ist der häufigste Erreger der Antibiotika-assoziierten Diarrhö und der pseudomembranösen Kolitis. Der Keim produziert neben zwei Proteintoxinen (Toxin A und B), die bislang als die entscheidenden Pathogenitätsfaktoren angesehen werden, ein weiteres Exotoxin, die C. difficile Transferase (CDT). Dabei handelt es sich um eine binär aufgebaute ADP-Ribosyltransferase, die mit den binären Toxinen von C. botulinum (C2-Toxin) und C. perfringens (Iota-Toxin) verwandt ist. Die Transferase besteht aus der Enzymkomponente CDTa (48 kDa) und der Binde- und Transportkomponente CDTb (94 kDa). CDTa ADP-ribosyliert monomeres G-Aktin und führt so zu einer Hemmung der Aktinpolymerisation und zum Zusammenbruch des Aktin-Zytoskeletts. <br>In der vorliegenden Arbeit wurde eine Struktur-Funktions-Analyse der Enzymkomponente CDTa durchgeführt. Zunächst wurde die Substratspezifität von CDTa untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das ADP-ribosylierende Toxin von C. difficile sowohl zelluläres -Aktin als auch -Skelettmuskelaktin modifiziert und somit dieselbe Substratspezifität wie Iota-Toxin besitzt. <br>Das katalytische Zentrum der Enzymkomponente wurde mittels zielgerichteter Mutagenese identifiziert. 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In der vorliegenden Arbeit wurde eine Struktur-Funktions-Analyse der Enzymkomponente CDTa durchgeführt. Zunächst wurde die Substratspezifität von CDTa untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das ADP-ribosylierende Toxin von C. difficile sowohl zelluläres -Aktin als auch -Skelettmuskelaktin modifiziert und somit dieselbe Substratspezifität wie Iota-Toxin besitzt.
Das katalytische Zentrum der Enzymkomponente wurde mittels zielgerichteter Mutagenese identifiziert. Der Austausch der Glutamatreste an Position 428 und 430 gegen Glutamin verursachte den vollständigen Verlust der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität von CDTa. Der Austausch von Serin-388 gegen Alanin sowie von Arginin-345 gegen Lysin führte ebenfalls zu einer deutlichen Verminderung der Enzymaktivität. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es sich bei Glutamat-430 um das in allen ADP-Ribosyltransferasen konservierte „katalytische“ Glutamat handelt. Mit Glutamat-428, Serin-388 und Arginin-345 wurden weitere, für die Funktion von CDTa essentielle, Aminosäuren identifiziert.
Da ein N-terminal verkürztes Fragment der C. difficile Transferase, CDTa244-463, eine deutlich verminderte ADP-Ribosyltransferase-Aktivität verglichen mit dem Holotoxin CDTa aufwies, ist zu vermuten, dass die enzymatische Domäne des C-Terminus von CDTa seinen N-Terminus zur korrekten Faltung und/oder Stabilisierung benötigt.
Im Rahmen der Arbeit wurde weiterhin ein chimäres Toxin aus CDTa1-240 und der ADP-Ribosyltransferase C3lim konstruiert. Versuche mit diesem Fusionsprotein deuten darauf hin, dass der N-terminale Teil von CDTa (Aminosäuren 1-240) eine Adapterfunktion für die Interaktion mit der Bindekomponente besitzt. In Anwesenheit der Bindekomponente des Iota-Toxins wurde das chimäre Toxin CDTa1-240-C3lim in Vero-Zellen aufgenommen und führte, wahrscheinlich durch eine ADP-Ribosylierung des C3lim Substrats Rho, zu einer Abrundung der Zellen.","Clostridium difficile is the causative pathogen of antibiotic-associated diarrhea and pseudomembranous colitis. It produces two major protein toxins (toxins A and B), which so far are regarded as the major virulence factors. Beside toxins A and B, some strains of C. difficile produce a binary ADP-ribosylating toxin (CDT) which is related to the binary toxins of C. botulinum (C2-toxin) and C. perfringens (Iota-toxin).
The binary CDT is composed of the enzymatic component, CDTa (48 kDa), and the binding and translocation component, CDTb (94 kDa), which mediates cell entry of CDTa. The enzyme component is suggested to ADP-ribosylate monomeric G-actin and thereby blocks the actin polymerisation which induces the breakdown of the actin-cytoskeletton of the cells.
In this thesis a structure-function-analysis of the enzyme component CDTa was performed. First of all the substrate specificitiy of CDTa was investigated and it was shown, that CDTa ADP-ribosylates nonmuscle (-) and skeletal muscle (-) actin, showing the same substrate specificity as iota toxin.
The catalytic amino acids of the enzyme component were identified using site-directed mutagenesis. Mutation of the glutamates 428 and 430 to glutamine caused the complete loss of ADP-ribosyltransferase activity of CDTa. Mutation of serine-388 to alanine and arginine-345 to lysine reduced the enzyme activity significantly. Our results indicate, that glutamat-430 represents the “catalytic glutamate”, which is highly conserved in all ADP-ribosyltransferases. With glutamate-428, serine-388 and arginine-345 further amino acids were identified, which are essential for the function of CDTa.
As an N-terminally truncated fragment of the C. difficile ADP-ribosyltransferase, CDTa244-463, was markedly less active than the full-length CDTa, it is likely, that the enzymatic domain of the C-terminal part of CDTa needs its N-terminal part for proper folding and/or stability.
Experiments with a chimeric protein composed of CDTa1-240 and the ADP-ribosyltransferase C3lim suggested, that the N-terminal part of CDTa (amino acids 1-240) is required for interaction of the enzyme component with its binding component. In the presence of Ib (the binding component of Iota toxin), the chimeric toxin CDTa1-240-C3lim was able to enter Vero-cells and to change their morphology, probably by ADP-ribosylating Rho, which is the substrate of C3lim."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferase CDTa von Clostridium difficile","Characterization of the ADP-ribosyltransferase toxin CDTa from Clostridium difficile"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Aktories, Klaus"],"dc:creator":["Gülke, Irene Sophie"],"dc:description.abstract":["Clostridium difficile ist der häufigste Erreger der Antibiotika-assoziierten Diarrhö und der pseudomembranösen Kolitis. Der Keim produziert neben zwei Proteintoxinen (Toxin A und B), die bislang als die entscheidenden Pathogenitätsfaktoren angesehen werden, ein weiteres Exotoxin, die C. difficile Transferase (CDT). Dabei handelt es sich um eine binär aufgebaute ADP-Ribosyltransferase, die mit den binären Toxinen von C. botulinum (C2-Toxin) und C. perfringens (Iota-Toxin) verwandt ist. Die Transferase besteht aus der Enzymkomponente CDTa (48 kDa) und der Binde- und Transportkomponente CDTb (94 kDa). CDTa ADP-ribosyliert monomeres G-Aktin und führt so zu einer Hemmung der Aktinpolymerisation und zum Zusammenbruch des Aktin-Zytoskeletts.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine Struktur-Funktions-Analyse der Enzymkomponente CDTa durchgeführt. Zunächst wurde die Substratspezifität von CDTa untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das ADP-ribosylierende Toxin von C. difficile sowohl zelluläres -Aktin als auch -Skelettmuskelaktin modifiziert und somit dieselbe Substratspezifität wie Iota-Toxin besitzt.
Das katalytische Zentrum der Enzymkomponente wurde mittels zielgerichteter Mutagenese identifiziert. Der Austausch der Glutamatreste an Position 428 und 430 gegen Glutamin verursachte den vollständigen Verlust der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität von CDTa. Der Austausch von Serin-388 gegen Alanin sowie von Arginin-345 gegen Lysin führte ebenfalls zu einer deutlichen Verminderung der Enzymaktivität. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es sich bei Glutamat-430 um das in allen ADP-Ribosyltransferasen konservierte „katalytische“ Glutamat handelt. Mit Glutamat-428, Serin-388 und Arginin-345 wurden weitere, für die Funktion von CDTa essentielle, Aminosäuren identifiziert.
Da ein N-terminal verkürztes Fragment der C. difficile Transferase, CDTa244-463, eine deutlich verminderte ADP-Ribosyltransferase-Aktivität verglichen mit dem Holotoxin CDTa aufwies, ist zu vermuten, dass die enzymatische Domäne des C-Terminus von CDTa seinen N-Terminus zur korrekten Faltung und/oder Stabilisierung benötigt.
Im Rahmen der Arbeit wurde weiterhin ein chimäres Toxin aus CDTa1-240 und der ADP-Ribosyltransferase C3lim konstruiert. Versuche mit diesem Fusionsprotein deuten darauf hin, dass der N-terminale Teil von CDTa (Aminosäuren 1-240) eine Adapterfunktion für die Interaktion mit der Bindekomponente besitzt. In Anwesenheit der Bindekomponente des Iota-Toxins wurde das chimäre Toxin CDTa1-240-C3lim in Vero-Zellen aufgenommen und führte, wahrscheinlich durch eine ADP-Ribosylierung des C3lim Substrats Rho, zu einer Abrundung der Zellen.","Clostridium difficile is the causative pathogen of antibiotic-associated diarrhea and pseudomembranous colitis. It produces two major protein toxins (toxins A and B), which so far are regarded as the major virulence factors. Beside toxins A and B, some strains of C. difficile produce a binary ADP-ribosylating toxin (CDT) which is related to the binary toxins of C. botulinum (C2-toxin) and C. perfringens (Iota-toxin).
The binary CDT is composed of the enzymatic component, CDTa (48 kDa), and the binding and translocation component, CDTb (94 kDa), which mediates cell entry of CDTa. The enzyme component is suggested to ADP-ribosylate monomeric G-actin and thereby blocks the actin polymerisation which induces the breakdown of the actin-cytoskeletton of the cells.
In this thesis a structure-function-analysis of the enzyme component CDTa was performed. First of all the substrate specificitiy of CDTa was investigated and it was shown, that CDTa ADP-ribosylates nonmuscle (-) and skeletal muscle (-) actin, showing the same substrate specificity as iota toxin.
The catalytic amino acids of the enzyme component were identified using site-directed mutagenesis. Mutation of the glutamates 428 and 430 to glutamine caused the complete loss of ADP-ribosyltransferase activity of CDTa. Mutation of serine-388 to alanine and arginine-345 to lysine reduced the enzyme activity significantly. Our results indicate, that glutamat-430 represents the “catalytic glutamate”, which is highly conserved in all ADP-ribosyltransferases. With glutamate-428, serine-388 and arginine-345 further amino acids were identified, which are essential for the function of CDTa.
As an N-terminally truncated fragment of the C. difficile ADP-ribosyltransferase, CDTa244-463, was markedly less active than the full-length CDTa, it is likely, that the enzymatic domain of the C-terminal part of CDTa needs its N-terminal part for proper folding and/or stability.
Experiments with a chimeric protein composed of CDTa1-240 and the ADP-ribosyltransferase C3lim suggested, that the N-terminal part of CDTa (amino acids 1-240) is required for interaction of the enzyme component with its binding component. In the presence of Ib (the binding component of Iota toxin), the chimeric toxin CDTa1-240-C3lim was able to enter Vero-cells and to change their morphology, probably by ADP-ribosylating Rho, which is the substrate of C3lim."],"dc:format.medium":["application/pdf"],"dc:subject":["ADP-Ribosylierung","Clostridium difficile","Bakterielle Toxine","Aktin","ADP-ribosylation","bacterial toxins","actin"],"dc:title":["Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferase CDTa von Clostridium difficile","Characterization of the ADP-ribosyltransferase toxin CDTa from Clostridium difficile"],"dc:type":["DoctoralThesis"]},"updated_at":"2026-07-24T02:22:16Z"}