Untersuchungen zum molekularen Wirkmechanismus der antiinflammatorischen Aktivität von Sesquiterpenlactonen

In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur antiphlogistischen Aktivität der Sesquiterpenlactone (SLs) auf molekularer Ebene durchgeführt, um die Kenntnisse für die Wirksamkeit dieser Substanzklasse zu erweitern und dem Modell, Sesquiterpenlactone als Leitstrukturen für neue entzündungshemmende Arzneistoffe zu verwenden, näher zu kommen. <br>1. 5 Furanoheliangolide aus Viguiera sylvatica wurden auf ihre hemmende Wirkung bezüglich des Transkriptionsfaktors NF-kB im EMSA getestet. Alle 5 SLs hemmten die Aktivität des Transkriptionsfaktors in Konzentrationen von 5-50 µM. Desweiteren wurden 4 Lignane aus Phenax mexicanus untersucht, wobei keine signifikante Beeinträchtigung der DNA-Bindung nachgewiesen werden konnte. <br>2. Um klären zu können, ob und in welchem Maße Naturstoffe die durch NF-kB-ausgelöste Genexpression beeinflussen, wurden zwei stabil transfizierte epitheliale Zelllinien (293-Zellen) etabliert, deren Reportergen-Konstrukte entweder ein von NF-kB-kontrolliertes Luciferase-Gen oder b-Galactosidase-Gen enthielten. In ex-vivo und in-vitro Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass SLs und NEM, ein Reagenz zur selektiven Alkylierung von Cys-Resten in Proteinen, die Luciferase-Aktivität durch einen direkten Angriff des Enzyms hemmten, während b-Galactosidase unbeeinflusst blieb. <br>3. Für verschiedene SLs wurde im b-Galactosidase-Assay eine konzentrationsabhängige Hemmung der NF-kB-abhängigen Genexpression nachgewiesen, wobei die Versuche mit transient transfizierten Zellen durchgeführt werden mussten, da die Substanzen in den untersuchten Konzentrationen für die stabil transfizierten Zellen cytotoxisch waren. Mit Hilfe des b-Galactosidase-Assays (stabil transfizierte Zellen) konnte gezeigt werden, dass die Behandlung der Zellen mit den Histon-Deacetylase-Hemmern Trichostatin A bzw. D237 zu einer Erhöhung sowohl der basalen als auch TNF-a-induzierten Aktivierung des Reportergens führte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass HDAC an der Regulation der Transaktivierungs-Funktion von NF-kB beteiligt sind. Schließlich wurden mit Hilfe des Luciferase-Assays die bereits im EMSA untersuchten Lignane getestet. Diese hemmten konzentrationsabhängig die Genexpression, wobei das Lignan 3 die stärkste Hemmaktivität aufwies. <br>4. Weiterhin wurde der Effekt von zwei Cys-Resten in p65 (Cys38 und Cys120) auf deren DNA-Binde- und Transaktivierungs-Eigenschaften hin untersucht, wobei die mit Luciferase als Reportergen stabil transfizierte Zelllinie verwendet wurde. Fünf p65-Mutanten (Cys38 - Ser, Cys38,120-Ser, Cys120 - Ser, Cys120 - Ala, Cys120 - Gly) wurden mit dem Wildtyp verglichen. Die Mutationen dieser Aminosäuren führte zu unterschiedlich starken Veränderungen der DNA-Bindestärke im Vergleich zum Wildtyp. <br>5. Mit Hilfe der cDNA-Microarray-Technik wurde untersucht, inwieweit SLs wie Parthenolid die Transkription verschiedener Gene auf mRNA-Ebene beeinflussen und inwieweit auch neue Targets für SLs, außer NF-kB, gefunden werden können. Dabei wurden aus 7028 Genen insgesamt 40 durch Parthenolid beeinflusste Gene, die mindestens um den Faktor 2.5 moduliert wurden, erhalten. 21 Gene davon wurden hochreguliert und 19 Gene gehemmt. Einige der im Microarray erhaltenen Daten wurden mittels quantitativer real-time RT-PCR bestätigt. <br>6. Die Untersuchungen mit real-time RT-PCR wurden ausgeweitet und die konzentrationsabhängige Beeinflussung von Parthenolid auf die Expression 19 verschiedener Gene wie Chemokine, Cytokine, verschiedene Enzyme, Rezeptoren und Transkriptionsfaktoren auf mRNA-Ebene untersucht. Es zeigte sich, dass die Gene unterschiedlich stark exprimiert wurden und zum anderen auch die Hemmung/Aktivierung durch Parthenolid unterschiedlich stark ausfiel. <br>7. Am Beispiel von IL-8 wurde untersucht, wie sich die Hemmungen von NF-kB und die mRNA-Bildung verschiedener NF-kB regulierter Gene auf Proteinebene auswirken. Hierzu wurde zunächst ein IL-8-ELISA etabliert, und anschließend wurden 24 unterschiedlich strukturierte SLs, welche sich im Grundgerüst und in der Anzahl ihrer reaktiven Zentren unterschieden, untersucht und ihre IC50-Werte bestimmt. Alle untersuchten SLs hemmten die TNF-a-vermittelte IL-8-Produktion konzentrationsabhängig. <br>8. Von den unter Punkt 7 aufgeführten Sesquiterpenlactonen und deren Hemmeigenschaften auf die IL-8-Produktion (IC50-Werte) bzw. auf den Transkriptionsfaktor NF-kB (IC100-Werte) wurden QSAR-Berechnungen durchgeführt. Dazu wurden die energieärmsten Konformationen zur Berechnung von physikochemischen Deskriptoren verwendet. Anschließend wurden in einer QSAR-Untersuchung mittels einer multiplen linearen Regressionsanalyse Korrelationen zwischen der Aktivität und den Deskriptoren aufgestellt. Es zeigte sich, dass die a-Methylen-g-lacton-Struktur und die Anwesenheit und Reaktivität eines zweiten Reaktionszentrums, ausgedrückt durch LUMO2, sowohl für die IL-8- als auch NF-kB-Hemmung die wichtigsten Parameter darstellen.

Author dc:creator

• Lindenmeyer, Maja Tamara

Contributors dc:contributor

• Merfort, Irmgard

• NF-kappaB
• Interleukin-8
• Reportergen-Assay
• cDNA-Microarray
• Quantitative real-time RT-PCR
• Sesquiterpenlactones
• reportergene assay

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