Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Legumain-Gens im Modellsystem Maus

Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Legumain-Gens im Modellsystem Maus <br> <br>Die Asparaginyl-Endopeptidase Legumain gehört zu den Cystein-Peptidasen und ist im Lysosomen aktiv. Zur Zeit ist sie der einzige Vertreter in der Peptidasefamilie C13 der Säuger. Ursprünglich wurde Legumain in Pflanzen (Bohnen, Leguminosen) und später in Wirbellosen entdeckt. Legumain ist ubiqutiär exprimiert und hat seine höchste Expressionsrate in der Niere und der Plazenta. <br>Zur Charakterisierung des genomischen Lokus und zur Identifikation von spezifischen in vivo Funktionen der Asparaginyl-Endopeptidase Legumain wurde im Rahmen dieser Arbeit der genomische Lokus des Legumain-Gens charakterisiert werden und eine für diese Peptidase defiziente Mauslinie durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen gewonnen. Zunächst wurde zur Vervollständigung der Genstruktur von Legumain genomische Fragmente aus der RPCI-21 Maus PAC-Bank isoliert und subkloniert, die 33 kb der Genregion abdecken. Mit diesen Plamidsubklonen konnte bis auf wenige hundert bp zusammen mit bereits bestehenden Plasmidsubklonen aus einer &#955;2001-Maus-Phagenbank der gesamte genomische Legumain-Lokus von ca. 45 kb isoliert und charakterisiert werden. So wurden 14 Exons und Introns identifiziert. Mit Hilfe eines RFLPs und einer interspezifischen Rückkreuzung wurde das Legumain-Gen wurde chromosomal am distalen Ende des Maus-Chromosoms 12 lokalisiert. Die Bestimmung des Transkriptionsstarts mit Primer-Extension ergab, daß ein singulärer Transkriptionsstart des Gens 223 Nukleotide vor Exon 1 liegt. Eine computergestützte Analyse der Promotorregion identifizierte putative Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, welche das Gen als ein mögliches Housekeeping Gen ausweisen. <br>Mit dem bestehenden Rekombinationskonstrukt pMLE-Neo1 wurden embryonale Stammzellen der isogenen ES-Zellinie HM-1 elektroporiert und der legumaindefiziente Mausstamm 3HLeg130 generiert. Die vollständige Inaktivierung des Gens wurde auf Transkriptions- Translations- und Proteinebene bestätigt. Die Mäuse sind lebensfähig. Es wurde versucht die in vivo Funktion des Legumain-Gens anhand der Knock-Out Mäuse zu analysieren. Dabei wurden von allen wichtigen Grundorganen histologische Präparate angefertigt, und die Knochenanatomie osteodensitometrisch und röntgenologisch bestimmt. Die legumaindefizienten Tiere sind fertil und zeigen in allen untersuchten Merkmalen keine Unterschiede zu Wildtypkontrolltieren. Eine breitangelegter Screen für dysmorphologische, klinisch-chemische, biochemisch-metabolische, immunologische und lysosomale Parameter wurde in Zusammenarbeit mit dem ENU Mutagenese Screen in München durchgeführt. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen allen drei Genotypgruppen der Legumain Mauslinie 3HLeg130 konnten für die beiden Parameter Carnitin und Arginin im biochemisch-metabolischen Screen durch Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie festgestellt werden. Sowohl die Werte für Carnitin als auch Arginin sind in der Gruppe der -/- Mäuse erniedrigt. Dies sind die ersten erkannten phänotypischen Merkmalsausprägungen des legumaindefizienten Mausstamms. Weitere in vivo Analysen in der Immunolgie durch Antigenpräsentations Assays widerlegten die Hypothese, daß Legumain eine maßgebliche Rolle bei der Prozessierung des mikrobiellen Antigen Tetanus Toxoid spielt. <br>Die Legumaindefizienz hat im murinen Organismus in allen untersuchten Parametern keine Auswirkungen, bis auf in Arginin und Carnitin.

Author dc:creator

• Werber, Ingrid

Contributors dc:contributor

• Peters, Christoph

• Legumain
• Asparaginyl-Endopeptidase (AEP)
• in vivo Funktion
• Genstruktur
• Legumain (Asparginyl-Endopeptidase AEP)
• Cysteine-Peptidase
• Gene Targeting
• Arginine
• Carnitine

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