Untersuchungen zur Wechselwirkung von Gallensalz tragenden Liposomen mit Hepatozyten

Das Gallensalz Lithocholyltaurin (LCT) wurde kovalent mit dem Phospholipid Distearoyl-sn-glycero-3-phosphethanolamin (DSPE) verknüpft und die Gallensalz-Lipid-Konjugate 3alpha-LCT-DSPE und 3beta-LCT-DSPE wurden hergestellt und charakterisiert. <br>Aus Lipidgemischen, die 1 Mol-% 3alpha-LCT-DSPE oder 3beta-LCT-DSPE enthielten, wurden Liposomen hergestellt. Die hergestellten Gallensalz tragenden Liposomen (GSL) wiesen einen Radius von etwa 120 nm auf und waren weitgehend unilamellar. <br>Möglicherweise können GSL für eine hepatotrophe Wirkstoffapplikation genutzt werden, und die Wechselwirkung der GSL mit Hepatozyten wurde eingehend untersucht. <br>Die Anwesenheit von Liposomen führt bei frisch isolierten Hepatozyten und Hepatozyten in Primärkultur zu einer Verringerung der Aufnahmegeschwindigkeit von Cholyltaurine (CT), die Verringerung der Aufnahmegeschwindigkeit ist von der Konzentration der Liposomen abhängig. Die Verringerung der Aufnahmegeschwindigkeit ist für GSL deutlich größer als für Kontroll-Liposomen (KOL). GSL treten mit allen 3 kinetisch unterscheidbaren Transportsystemen für CT in Wechselwirkung. <br>Zur Untersuchung der Bindung von GSL an frisch isolierte Hepatozyten wurden 3 unterschiedliche Methoden zur Abtrennung der ungebundenen Liposomen von den Hepatozyten miteinander verglichen. Die Methode der Zentrifugalverdünnung eignet sich am besten zur Untersuchung der Gallensalz vermittelten Bindung, bei der Zentrifugalfiltration und der Membranfiltration werden locker gebundene Liposomen in größerem Ausmaß von den Hepatozyten entfernt, und diese Methoden weisen eine größere Fehlerbreite auf. Mit allen 3 untersuchten Methoden konnte eine signifikante Gallensalz vermittelte Bindung von GSL an die Hepatozyten nachgewiesen werden. <br>Die Bindung der GSL an frisch isolierte Hepatozyten ist von der Konzentration an liposomalem Phosphatidylcholin abhängig, sie ist sättigbar und zeigt eine positive Kooperativität. Der Hillkoeffezient für die Kooperativität beträgt etwa 1,9. <br>Die Bindungseigenschaften der GSL sind von der Stereochemie der Verknüpfung in der 3-Position des Gallensalzes abhängig, 3beta-LCT-DSPE tragende Liposomen können in deutlich größerem Ausmaß an die Hepatozyten binden, als 3alpha-LCT-DSPE tragende Liposomen. Die scheinbare Spezifitätskonstante für die Bindung von 3beta-LCT-DSPE tragenden Liposomen ist größer als die scheinbare Spezifitätskonstante für die Bindung von 3alpha-LCT-DSPE tragende Liposomen. Frisch isolierte Hepatozyten können bei vollständiger Sättigung der durch 3beta-LCT-DSPE vermittelten Bindung etwa 14 nmol liposomales PC/mg Hepatozytenprotein binden, dies entspricht etwa 118000 gebundenen Liposomen je Zelle. <br>GSL binden an die Oberfläche der Hepatozyten, innerhalb von 8 Stunden findet keine vermittelte oder unspezifische Endozytose der gebundenen Liposomen statt. Die gebundenen Liposomen sammeln sich im Laufe der Zeit in Mikrovilli ähnlichen Strukturen auf der Zelloberfläche. <br>Die Gallensalz vermittelte Bindung kann durch die Anwesenheit von gelöstem CT moduliert werden. Eine Aktivierung des Gallensalztransportes durch CT führt zu einer verstärkten Bindung von Gallensalz tragenden Liposomen. Die Gallensalz vermittelte Bindung selbst löst keine Aktivierung des intrazellulären MAP-Kinase-Signalweges aus. Die Aktivierung des Gallensalztransportes von Hepatozyten wird sehr wahrscheinlich durch intrazelluläre Rezeptoren gesteuert. <br>Eine Inhibition der ATP-Synthese der Hepatozyten führt zu einer verstärkten und beschleunigten Bindung von Gallensalz tragenden Liposomen. Wahrscheinlich wird die Zahl der Transporter in der Zytoplasmamembran erhöht und zumindest einige Transporter liegen vermehrt in ihrer aktiven, nicht phosphorylierten Form vor. <br>Die Bindung der GSL an die Oberfläche der Hepatozyten ist ein komplexer Prozess, an dem mehrere Prozesse und verschiedene Transportproteine beteiligt sind. Auf eine schnelle, reversible Ausbildung eines ersten Gallensalzlipid-Transporter-Komplexes folgt die Verankerung des Liposoms über die Ausbildung weiterer Gallensalzlipid-Transporterkomplexe. Für die Verankerung der Liposomen können zwei Prozesse unterschieden werden, die mit unterschiedlichen Halbwertszeiten ablaufen. Die Geschwindigkeit der Bindungsprozesse ist von der Konzentration an Liposomen abhängig. An der Ausbildung des ersten Gallensalzlipid-Transporter-Komplexes ist der Gallensalztransporter Ntcp in seiner aktiven Form maßgeblich beteiligt. <br>Lang zirkulierende GSL werden in vivo im Gegensatz zu entsprechenden langlebigen KOL in der Leber angereichert. In der Leber sind die GSL entlang der Sinusoide orientiert, lang zirkulierende GSL können auch in vivo mit den Hepatozyten in Wechselwirkung treten. <br>Gallensalze sind grundsätzlich als hepatotroper Anker für entsprechende Liposomen geeignet, und Carrier für niedermolekulare Substanzen sind grundsätzlich in der Lage, eine Bindung und eine Verankerung von entsprechenden Liposomen zu vermitteln.

Author dc:creator

• Pütz, Gerhard

Contributors dc:contributor

• Gräber, Peter

• Targeted drug delivery
• liver
• hepatocyte
• liposome
• bile salts

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