Desarrollo de sistema lentiviral para la codificación de un short hairpin RNA que permite el silenciamiento dual de las oncoproteínas E6 y E7 de HPV16 en células de pulmón humano

Introducción: El virus papiloma humano (HPV) es el agente causal del cáncer de cuello uterino (CCU) y de un subgrupo de tumores de cabeza y cuello, siendo HPV16 el más prevalente. Este virus de alto riesgo neoplásico también ha sido detectado en tejido pulmonar tumoral, pero su rol etiológico en esta enfermedad es aún controversial. La oncogenicidad de HPV16 está mediada por la sobreexpresión de E6 y E7 que inducen la pérdida de función de los genes supresores de tumor p53 y pRB respectivamente, siendo considerados el blanco ideal para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas contra el cáncer. La producción de un intermediario de siRNA denominado short-hairpin RNA (shRNA), es un sistema eficiente de supresión de un transcrito blanco específico, que puede actuar durante varias generaciones celulares. Los vectores lentivirales son un sistema seguro y eficiente de empaquetamiento, capaces de infectar células permisivas y de integrar su genoma recombinante al genoma celular. Objetivo: Desarrollar un sistema de expresión lentiviral para la codificación de un short-hairpin RNA que permita el silenciamiento dual de los oncogenes E6 y E7 de HPV16 en líneas celulares que expresan estas oncoproteínas. Metodología: Se co-transfectaron células 293T con los vectores AR8.1, VSV-g y el vector recombinante pLKO.1-shRNA (1-4), y se recuperaron vectores lentivirales capaces de transducir células A549pLXSNE6E7. Las células transducidas A549pLXSNE6E7 pLKO.1-shRNA (1-4) obtenidas, fueron utilizadas para evaluar los niveles de transcritos de E6, E7 y hTERT, y los niveles proteicos de p53, pRB, E6 y E7. Su análisis fenotípico se realizó evaluando la capacidad de crecimiento libre de anclaje de las células mediante su crecimiento en soporte semisólido de agar. Resultados: Se lograron desarrollar vectores lentivirales infectivos capaces de transducir e integrar su genoma recombinante en células A549pLXSNE6E7. Los shRNAs expresados, permitieron reducir la expresión relativa del transcrito bicistrónico de E6 y E7, y del transcrito hTERT. El análisis proteico demostró un aumento de los niveles de las proteínas p53 y pRB en células A549pLXSNE6E7 transducidas. El análisis fenotípico reveló una reducción del número de focos de crecimiento en presencia de SH2. Conclusiones: Los resultados presentados en esta Tesis, han dado cuenta de la actividad interferente de los shRNA diseñados sobre el transcrito bicistrónico de E6 y E7, permitiendo en consecuencia una reducción de las oncoproteínas virales y una reducción parcial del número de focos de crecimiento de células A549pLXSNE6E7 en ausencia de una matriz extracelular. Finalmente, estos datos permiten indicar que desarrollamos vectores lentivirales eficientes para la transducción de células de adenocarcinoma pulmonar, que logran la integración estable de un vector recombinante codificante de un shRNA constitutivo. Los vectores lentivirales codificantes para shRNA serían útiles herramientas moleculares para el estudio funcional de los oncogenes virales E6 y E7 de HPV16 en un modelo celular pulmonar.

Grantor dc:publisher

Universidad de Chile

Year dc:date.issued

2013

Author dc:creator

• Parra Rivas, Bárbara Andrea

Advisor dc:contributor.advisor

• Aguayo González, Francisco

• Técnicas de silenciamiento del gen
• Neoplasias pulmonares
• Papillomavirus Humano 16
• Proteínas oncogénicas virales - Genética
• Interferencia de ARN

Statement dc:rights

• Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States

Licence dc:rights.uri

• http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/us/

Language dc:language.iso

es

Repository record dc:identifier.uri

https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/183533

OAI identifier oai:identifier

oai:repositorio.uchile.cl:2250/183533