L'applicazione delle metodologie del nuovo approccio in vitro per chiarire i meccanismi di potenziale tossicità dell'EVP e delle sigarette combustibili

Il fumo è una causa di gravi malattie nei fumatori tra cui il cancro ai polmoni, la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e le malattie cardiovascolari. Come riportato dall'OMS nel 2020 “il 22,3% della popolazione mondiale consumava tabacco, il 36,7% di tutti gli uomini e il 7,8% delle donne del mondo” [1] . Gli organismi di sanità pubblica riferiscono che il fumo è causa di gravi malattie nei fumatori, tra cui il cancro e le malattie respiratorie croniche [2-4]. Il CDC afferma che "ogni anno il fumo di sigaretta causa più di 480.000 morti ogni anno negli Stati Uniti" (vedi Figura 7) e che "il fumo porta a malattie e disabilità e danneggia quasi tutti gli organi del corpo" e, "più di 16 milioni di americani convivono con una malattia causata dal fumo” [4]. L'Organizzazione Mondiale della Sanità afferma che “Il tabacco uccide più di 8 milioni di persone ogni anno in tutto il mondo. Più di 7 milioni di questi decessi sono il risultato dell'uso diretto del tabacco, mentre circa 1,2 milioni sono il risultato dell'esposizione al fumo passivo di non fumatori.”[1] La cessazione completa di tutto il consumo di tabacco e nicotina è senza dubbio la migliore azione che i fumatori adulti possono intraprendere per migliorare la propria salute, ma per quegli individui che non sono interessati o disposti a smettere di fumare, la transizione verso alternative NGP potenzialmente dannose come l'EVP è la prossima migliore opzione. Il concetto di Tobacco Harm Reduction (THR) è stato introdotto nel 2001 dal rapporto dello US Institute of Medicine: “Clearing the Smoke” [12] . Questo documento definisce a grandi linee la THR come tutti i mezzi per ridurre i danni alla salute dei fumatori che non sono interessati o non vogliono smettere di consumare nicotina attraverso metodi tradizionali (ad esempio il fumo di sigaretta), incoraggiando la loro sostituzione con altri prodotti contenenti nicotina che potenzialmente comportano minori rischi [13]. "Clearing the Smoke" è stato il primo riconoscimento ufficiale che la nicotina può essere fornita ai fumatori senza gli effetti nocivi del fumo di sigaretta (formato durante la combustione del tabacco). Gli organismi di sanità pubblica che sostengono il concetto di Tobacco Harm Reduction (THR), accettano che non sia la nicotina ma i costituenti nocivi e potenzialmente dannosi (HPHC) generati dalla combustione del tabacco e trovati nel fumo di sigaretta che causano, o potenzialmente causano, malattie legate al fumo. La scienza e la tecnologia sono progredite a un ritmo senza precedenti negli ultimi decenni. Separando la nicotina dal fumo nocivo del tabacco, esiste la possibilità di fornire ai fumatori adulti alternative al fumo potenzialmente meno dannose. Numerosi organismi di sanità pubblica hanno incoraggiato i fumatori adulti di sigarette che non sono interessati o non vogliono smettere di fumare a passare a prodotti contenenti nicotina, che potenzialmente presentano meno rischi per la salute [5-7]. Tra questi prodotti la categoria EVP rappresenta l'alternativa più promettente e meno dannosa alle sigarette, in quanto dimostra il ridotto potenziale di rischio e allo stesso tempo ottiene l'accettazione da parte del fumatore imitando con successo molti degli aspetti comportamentali e sensoriali dell'esperienza del fumo [8]. Recenti studi clinici hanno dimostrato che i fumatori adulti che sono passati agli EVP sono esposti a livelli sostanzialmente inferiori e significativamente inferiori di agenti cancerogeni e tossici presenti nel fumo di sigaretta, con livelli di biomarcatori di esposizione in gran parte indistinguibili dalla completa cessazione del fumo o dall'uso di nicotina farmaceutica approvata prodotti sostitutivi [9-17]. Questa tesi di dottorato mira a descrivere l'implementazione di questi NAM in vitro in linea con la visione stabilita dal TT21C, nel quadro di valutazione della sicurezza in vitro di Imperial Brands PLC. Si tratta inoltre di testare gli effetti dei prodotti EVP nell'ampia gamma di endpoint di test pertinenti con l'applicazione sia dei test in vitro approvati dalla regolamentazione che dei NAM e confrontare le risposte tossicologiche e biologiche complessive dell'EVP con quelle osservate come risultato dell'esposizione al fumo di sigaretta combustibile. Imperial Brands ha la politica di non condurre test sugli animali a meno che non venga richiesto da un organismo di regolamentazione riconosciuto. Con questo in mente e l'utilizzo di NAM in linea con la visione TT21C, per una valutazione tossicologica umana completa e rilevante dei prodotti EVP come potenziale strumento THR. Questo, insieme all'implementazione dei NAM nel programma di test di sicurezza in vitro di Imperial Brands, rientra nell'ambito di questa tesi di dottorato. Nel primo documento di dottorato, è stata utilizzata una batteria in vitro di test consolidati per esaminare la mutagenicità (test di mutazione inversa batterica; Ames), la genotossicità (test del micronucleo in vitro; IVM) e la citotossicità (test di assorbimento del rosso neutro; NRU) di e- liquidi e aerosol EVP con e senza nicotina in una gamma di aromi, da due sistemi EVP commerciali chiusi (blu PLUS+TM e blu GOTM) e rispetto al fumo di sigaretta combustibile. Sono state impiegate alcune modifiche per consentire l'esposizione rilevante per l'uomo dell'aerosol fresco e intero e del fumo. Nel test Ames e nei test IVM, le esposizioni a e-liquid e aerosol EVP, con e senza nicotina e in una gamma di aromi, non hanno mostrato effetti mutageni o genotossici rispetto al fumo di sigaretta di riferimento. Il test NRU ha mostrato una citotossicità significativamente ridotta (P<0,05) per i liquidi elettronici e gli aerosol EVP freschi, interi non diluiti, generati con una delle due sigarette elettroniche, rispetto al fumo di sigaretta di riferimento, che al contrario era marcatamente citotossico anche se diluito. In conclusione, le ridotte risposte tossicologiche acute in vitro degli EVP testati hanno determinato una risposta citotossica significativamente ridotta (riduzione da 250 a 1000 volte) degli aerosol EVP rispetto al fumo di sigaretta, che ha provocato una grave risposta tossicologica che ha portato alla mutazione e classificazione della genotossicità. Il documento di dottorato II ha presentato una proposta di estensione della batteria in vitro stabilita con l'integrazione meccanicistica dell'endpoint finito (genotossicità). L'analisi ToxTracker e Aneugen Clastogen Evaluation (ACE) può indicare l'attivazione di reporter associati a (geno)tossicità, inclusi danni al DNA, stress ossidativo, risposta allo stress correlata alla p53 e danni alle proteine. Nel test ToxTracker/ACE è stata valutata una selezione di e-liquid puri, aerosol EVP (estratti acquosi), campioni di fumo di sigaretta Kentucky 1R6F di riferimento (estratti acquosi e TPM) con una gamma di controlli positivi. Il test è stato inizialmente convalidato per valutare se una miscela di componenti base di e-liquid, glicole propilenico (PG) e glicerina vegetale (VG) con valori di osmolarità elevati noti, può interferire con le letture del sistema. La miscela PG/VG non ha influenzato notevolmente le risposte indotte dai composti di controllo positivi. Successivamente, rispetto ai campioni di fumo di sigaretta, gli e-liquid puri e gli aerosol bPBS (sapore di tabacco; 1,6% di nicotina a base libera, 1,6% di sale di nicotina o 0% di nicotina) hanno mostrato risposte ridotte e meno complesse. Testato fino a una concentrazione del 10%, l'aerosol bPBS di EVP non ha indotto alcun reporter ToxTracker. Gli e-liquid puri, testati fino all'1%, hanno indotto i reporter di stress ossidativo, ritenuti dovuti ai loro effetti sull'osmolarità in vitro. Il contenuto di nicotina dell'e-liquid non ha influenzato le risposte indotte. Inoltre, l'aggiunta di nicotina da sola ha indotto solo una risposta allo stress ossidativo a livello soprafisiologico. Nessuno dei campioni di EVP causa effetti genotossici nel test ToxTracker, contrariamente ai campioni derivati dalle sigarette che sono stati chiaramente classificati come genotossici e hanno mostrato un aumento sostanziale dei reporter dello stress ossidativo (Srxn-1 e Blvrb), che è uno di un ampio meccanismi riconosciuti delle patologie associate al fumo, come le malattie cardiovascolari, la broncopneumopatia cronica ostruttiva e il cancro del polmone [126-128]. Come osservato, il segnale Srxn1 associato a Nrf2 è diminuito a una concentrazione di test più elevata (10%), il che era in linea con una perdita di sopravvivenza cellulare che indica una grave citotossicità. Una delle spiegazioni di ciò potrebbe essere un eccessivo carico di stress ossidativo, che successivamente causa la morte cellulare incontrollata. Inoltre, è stata osservata una chiara induzione del Btg2-GFP associato a p53 e dei reporter del danno al DNA Rtkn dopo l'esposizione alla sigaretta. Questa induzione segnalata nel test ToxTracker dimostra la sua sensibilità verso i meccanismi correlati al danno al DNA e allo stress ossidativo. Al fine di eseguire una valutazione tossicologica ancora più rilevante per l'uomo degli NGP inalabili e del fumo di sigaretta combustibile, entrambi basati sulla migliore esposizione all'ALI, e con l'uso di modelli di tessuti complessi di origine umana, il PhD Paper III mirava a valutare il risposta trascrittomica da un tessuto RHuA disponibile in commercio (MucilAirTM) a seguito di una singola esposizione sub-citotossica al fumo di sigaretta intero fresco e alla dose equivalente, normalizzata alla somministrazione di nicotina, dell'aerosol intero fresco EVP. Non sono stati osservati cambiamenti strutturali o patologici in seguito all'esposizione a qualsiasi prodotto in entrambi i tempi di recupero (4 e 48 ore dopo l'esposizione). L'esposizione all'aerosol EVP non ha avuto alcun effetto su CBF, a né sull'integrità della barriera e sulle giunzioni della coscia, come indicato dalle misurazioni TEER al punto di recupero di 48 ore, rispetto rispettivamente all'incubatore e ai controlli dell'aria. Sebbene la a non sia stata influenzata, l'esposizione al fumo di sigaretta di riferimento ha determinato una significativa diminuzione del TEER, che come riportato nella letteratura scientifica è un'indicazione precoce della citotossicità [125], e un aumento significativo del CBF e di tutti i mediatori pro-infiammatori secreti sia a 4 che a 48 ore dopo l'esposizione rispetto ai controlli dell'aria corrispondenti al tempo equivalente. Il numero totale di geni significativamente espressi è stato minimo dopo l'esposizione all'aerosol EVP, dove l'esposizione al fumo di sigaretta 3R4F ha provocato un aumento significativo dei DEG e una chiara risposta in diversi percorsi chiave della malattia. L'esposizione al fumo di sigaretta determina l'arricchimento dei percorsi associati allo stress ossidativo e all'infiammazione. Al contrario, l'esposizione a una dose equivalente di nicotina di aerosol EVP mostra effetti minimi a tutti i livelli di organizzazione. Sebbene l'esposizione all'EVP abbia indotto una risposta simile a quella osservata dalle colture di tessuti esposte all'aria, sono stati influenzati diversi percorsi. Il documento di dottorato IV, basandosi sul lavoro precedente, mirava a valutare il potenziale THR dell'EVP rispetto a una sigaretta di riferimento, con l'uso di NAM e in linea con la visione del TT21C in una serie di endpoint funzionali correlati alle malattie respiratorie croniche. Al fine di rappresentare più fedelmente lo scenario di esposizione dell'utente, il modello di tessuto RHuA in vitro è stato ripetutamente esposto all'aerosol fresco, intero non diluito dell'EVP, o al fumo di sigaretta intero 3R4F, all'interfaccia aria-liquido (ALI), per 4 settimane per 30, 60 o 90 puff su base di 3 esposizioni a settimana. L'esposizione ripetuta del modello polmonare 3D all'ALI per 4 settimane riassume meglio l'uso del prodotto rispetto a un singolo punto di esposizione acuta. L'esposizione ad aerosol di EVP intero fresco non diluito non ha innescato cambiamenti significativi nel livello dei mediatori pro-infiammatori, nella funzione di battito delle ciglia, nell'integrità della barriera e nella citotossicità rispetto ai controlli aerei. Al contrario, l'esposizione al fumo di sigaretta fresco intero diluito (1:17) ha causato cambiamenti significativi a tutti gli endpoint sopra menzionati. A nostra conoscenza, questo è il primo studio che valuta gli effetti del fumo di sigaretta intero ripetuto e dell'intera esposizione all'aerosol EVP su un modello polmonare 3D presso l'ALI. I nostri risultati si aggiungono al crescente corpo della letteratura scientifica a sostegno del potenziale THR degli EVP rispetto alle sigarette combustibili e all'applicabilità dei modelli polmonari 3D nelle valutazioni del rischio del prodotto rilevanti per l'uomo. Sebbene sembri esserci una tendenza al rialzo per la maggiore concentrazione di EVP nei punti temporali successivi, i cambiamenti sono stati piccoli, temporanei e costantemente inferiori rispetto al fumo diluito 3R4F. Il CAA è stato significativamente ridotto dopo l'esposizione ripetuta a 90 puff di aerosol EVP da T16, tuttavia, il meccanismo d'azione non è chiaro. Altri endpoint come CBF, TEER, produzione di muco e citotossicità non erano significativamente differenti rispetto ai controlli aerei. Al contrario, l'esposizione al fumo di sigaretta diluito ha portato a notevoli cambiamenti nella morfologia dei tessuti (T26 per 60 boccate e T14 per 90 boccate 3R4F), ha ridotto significativamente le funzioni ciliari e il numero di ciglia a tutte le dosi testate. Sebbene l'esposizione a 60 e 90 puff di 3R4F non abbia indotto istologicamente l'iperplasia delle cellule caliciformi, l'aumento dei livelli di mediatori pro-infiammatori indica una risposta infiammatoria in risposta all'aumento della citotossicità. L'esposizione alla dose sub-citotossica di 30 boccate di fumo 3R4F non ha indotto iperplasia delle cellule caliciformi, potenzialmente a causa di un periodo di follow-up troppo breve o di una dose ancora troppo elevata. I dati in vitro qui presentati indicano che il prodotto EVP di alta qualità può fungere da potenziale strumento di riduzione del danno del tabacco, presentando nel complesso un rischio ridotto rispetto al fumo di sigaretta. È importante, tuttavia, notare che nessun prodotto contenente tabacco o nicotina è assolutamente privo di rischi. Inoltre, i risultati qui presentati mostrano un'applicazione riuscita dei NAM per la valutazione completa e rilevante del rischio tossicologico del prodotto per l'uomo. Queste tecniche si sono dimostrate robuste, sensibili e compatibili con la complessa composizione chimica degli articoli di prova. La scienza e la tecnologia sono progredite a un ritmo senza precedenti negli ultimi decenni. Separando la nicotina dal fumo nocivo del tabacco, esiste la possibilità di fornire ai fumatori adulti alternative al fumo potenzialmente meno dannose. È politica di Imperial Brands PLC non condurre test sugli animali e diverse autorità di regolamentazione in tutto il mondo stanno investendo nello sviluppo, nella convalida e nell'implementazione di NAM che siano rilevanti per l'uomo e robusti. Questo approccio richiede tempo, ma è assolutamente necessario ai fini della valutazione e dello screening del prodotto. Lo scopo di questa tesi di dottorato è descrivere l'implementazione dei suddetti NAM in linea con la visione stabilita dal TT21C nel quadro di valutazione della sicurezza in vitro di Imperial Brands PLC. I nuovi metodi di approccio (NAM), come stabilito dalle mie numerose agenzie di regolamentazione, come FDA [52], EPA [53] e NTP/ICCVAM [54], sono il futuro della valutazione preclinica del prodotto e offrono la visione meccanicistica di modalità di azione delle sostanze chimiche. questi test possono distinguere tra categorie di prodotti e all'interno. Può differenziare la potenziale opportunità per la riduzione del danno causato dal fumo di sigaretta. Supportati da valutazioni/studi clinici e comportamentali, essi fanno parte dell'approccio complessivo del peso dell'evidenza (WoE) a sostegno della categoria - valutazione del prodotto come parte di un quadro più ampio. I dati in vitro qui presentati indicano che il prodotto EVP di alta qualità può fungere da potenziale strumento di riduzione del danno del tabacco, presentando nel complesso un rischio ridotto rispetto al fumo di sigaretta. È importante, tuttavia, notare che nessun prodotto contenente tabacco o nicotina è assolutamente privo di rischi. Inoltre, i risultati qui presentati mostrano un'applicazione riuscita dei NAM per la valutazione completa e rilevante del rischio tossicologico del prodotto per l'uomo. Queste tecniche si sono dimostrate robuste, sensibili e compatibili con la complessa composizione chimica degli articoli di prova. La mia comprensione di quest'area è cambiata in modo significativo e credo che una ricerca più solida nella categoria in vitro possa aiutare a ridurre l'uso di animali nella valutazione del prodotto e possa costruire prove solide a sostegno di qualsiasi studio rilevante per l'uomo e dell'esposizione umana mentre prodotto è sul mercato.

Grantor dc:publisher

Università degli studi di Catania

Year dc:date

2023

Author dc:creator

• Czekala, Lukasz

Contributors dc:contributor

• POLOSA, Riccardo

• New Approach Methodologies, Nicotine, Electronic Nicotine Delivery Systems (ENDS), Electronic Vapour Products (EVP), Tobacco Harm Reduction (THR), Scientific Assessment Framework (SAF), Pre-clinical assessment, Toxicity Testing in the 21st Century (TT21C), Toxicology, Tobacco, Mutagenicity, Genotoxicity, Cytotoxicity, Transcriptomics, OMICS, RNA/DNA, Pro-inflammatory mediators, COPD, Lung disease, Immunohistochemistry, Air Liquid Interface (ALI), Organotypic lung models, 3D lung models, Cilia, Trans Epithelial Electrical Resistance (TEER), Dosimetry, Whole cigarette smoke, Whole EVP aerosol, Cigarettes, AMES, IVM, NRU, ToxTracker, Smoking robots, Gene Data Analysis
• Metodologie del nuovo approccio, Nicotina, Sistemi elettronici di consegna della nicotina (ENDS), Prodotti elettronici a vapore (EVP), Riduzione del danno da tabacco (THR), Quadro di valutazione scientifica (SAF), Valutazione preclinica, Test di tossicità nel 21° secolo (TT21C), Tossicologia, Tabacco, Mutagenicità, Genotossicità, Citotossicità, Trascrittomica, OMICI, RNA/DNA, Mediatori pro-infiammatori, Malattia polmonare, BPCO, Malattia polmonare, Immunoistochimica, Interfaccia aria liquido (ALI), Modelli polmonari organotipici, Modelli polmonari 3D, Ciglia, Resistenza elettrica transepiteliale (TEER), Dosimetria, Fumo di sigaretta intero, Aerosol EVP intero, Sigarette, AMES, IVM, NRU, ToxTracker, Robot fumatori, Analisi dei dati genetici

Statement dc:rights

• info:eu-repo/semantics/openAccess
• license:PUBBLICO - Pubblico con Copyright
• license uri:iris.PUB02

Language dc:language

ita

Handle dc:identifier

https://hdl.handle.net/20.500.11769/582148

OAI identifier oai:identifier

oai:www.iris.unict.it:20.500.11769/582148