Analisi elettrofisiologica delle proteine VDAC umane incorporate nei nanodischi e indagine sui residui di cisteina dell'isoforma 3 VDAC nella funzionalità mitocondriale e nel tamponamento dei ROS

I mitocondri sono organelli essenziali per le cellule eucariotiche poiché sostengono l'enorme richiesta energetica, necessaria per mantenere l'omeostasi cellulare. La comunicazione tra il citosol e i mitocondri è consentita dalle porine mitocondriali, note anche come Voltage-Dependent Anion Selective Channels (VDACs), localizzate nella membrana mitocondriale esterna di tutti gli eucarioti. Le proteine VDAC permettono gli scambi di metaboliti e partecipano a numerose vie cellulari grazie all'interazione con specifici enzimi citosolici e fattori apoptotici. Nei mammiferi esistono tre diverse isoforme, conosciute come VDAC1, VDAC2 e VDAC3. Pur condividendo un'alta omologia di sequenza, le tre isoforme presentano funzioni e caratteristiche diverse. La prima parte di questa tesi di dottorato si focalizza sull'analisi elettrofisiologica delle proteine VDAC prodotte utilizzando un sistema di espressione cell-free associato a nanodisc. Questo nuovo metodo di espressione rappresenta una potente alternativa per evitare le procedure di ripiegamento in vitro delle proteine. In questo lavoro, il sistema di sintesi proteica in vitro è stato usato per la prima volta per esprimere le tre isoforme VDAC. In particolare, è stato investigato se il sistema cell-free associato ai nanodisc, mantenesse inalterate le caratteristiche elettrofisiologiche dei canali VDAC. Inoltre, è stato valutato l'impatto sulle caratteristiche biofisiche di VDAC3 in seguito a pre-trattamento della proteina con agente riducente (DTT) e dopo la rimozione dei residui di cisteina nella sequenza amminoacidica mediante mutagenesi sito-diretta. I nostri risultati hanno dimostrato che questo nuovo sistema mantiene immutate le caratteristiche elettrofisiologiche delle proteine VDAC e inoltre ha convalidato l'estrema importanza dei residui di cisteina sull’attività canale di VDAC3. La seconda parte della tesi riguarda l'indagine del contributo di VDAC3 nella risposta allo stress ossidativo. VDAC3 rappresenta la meno abbondante e la più enigmatica isoforma ed è stata a lungo l'argomento di ricerca del gruppo di De Pinto. L’isoforma 3 presenta proprietà biofisiche atipiche che sono state attribuite allo stato ossidativo dei suoi residui di cisteina. Inoltre, alcune evidenze in letteratura hanno suggerito che VDAC3 potrebbe essere un sensore redox, sottolineando il suo coinvolgimento nell'omeostasi mitocondriale delle specie reattive dell'ossigeno. Una prova diretta, tuttavia, manca. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare il ruolo di VDAC3 sulla funzionalità mitocondriale utilizzando la linea cellulare umana HAP1 knock-out di VDAC3. Questo lavoro ha rivelato che VDAC3 previene il deterioramento mitocondriale indotto dallo stress ossidativo. Inoltre, è stato dimostrato, per la prima volta, che i residui di cisteina di VDAC3 sono responsabili della capacità della proteina di contrastare l’eccesso dei ROS mitocondriali.

Grantor dc:publisher

Università degli studi di Catania

Year dc:date

2022

Author dc:creator

• CONTI NIBALI, STEFANO

Contributors dc:contributor

• DE PINTO, Vito Nicola

• ROS, cysteines, mitochondria, VDAC, nanodisc, planar lipid bilayer
• ROS, Cisteine, mitocondri, VDAC, nanodisc, planar lipid bilayer

Statement dc:rights

• info:eu-repo/semantics/openAccess
• license:PUBBLICO - Pubblico con Copyright
• license uri:iris.PUB02

Language dc:language

ita

Handle dc:identifier

https://hdl.handle.net/20.500.11769/581386

OAI identifier oai:identifier

oai:www.iris.unict.it:20.500.11769/581386