Isolierung und strukturelle Charakterisierung von E-Selektin-bindenden Gangliosiden aus humanen Granulozyten

Aus den in der Literatur verfügbaren Daten ist bisher erst wenig über die exakten Strukturen von E-Selektin-bindenden Rezeptoren bekannt. Zunächst wurden für die drei bekannten Selektine (L-, E- und P-Selektin) Proteine identifiziert, die die Fähigkeit zur Adhäsion zeigten. Das Hauptepitop des E-Selektin-Rezeptors ESL-1 konnte als das Tetrasaccharid sLe x (Neu5Ac[alpha]2-3Gal[beta]1-4(Fuc[alpha]1-3)GlcNAc) charakterisiert werden. Da auch Glykolipide humanen Ursprungs diese Struktur tragen, stellt sich nun die Frage, ob auch sie in der Lage sind, als E-Selektin-Rezeptoren zu fungieren. Als Ausgangsmaterial standen Gangliosid-Fraktionen von einer Präparation humaner Granulozyten zur Verfügung (HGG-Fraktionen). Die Fraktion mit den als kurzkettig bezeichneten Gangliosiden enthielt hauptsächlich die Ganglioside GM3, IV3Neu5Ac-nLc4,IV6Neu5Ac-nLc4 und VI3Neu5Ac-nLc6. Die weiteren Fraktionen bestanden aus komplexen Gemischen von fukosylierten und nicht-fukosylierten Gangliosiden mit Poly-N-Acetyllaktosaminylketten, die als langkettige Strukturen bezeichnet wurden. Sie wurden isoliert und charakterisiert. Es wurde zunächst der analytische Nachweis erbracht, dass diese HGG-Fraktionen Ganglioside mit sLe x-Epitopen besitzen. Anschließende Untersuchungen zeigten, dass diese sLe x-Epitope an das Protein E-Selektin binden. Eine Hauptaufgabe dieser Arbeit war die strukturelle Charakterisierung der Ganglioside mit E-Seletin-Rezeptorfunktion. Sie wurden im wesentlichen durch Chromatographie getrennt und weiterhin mit den sich ergänzenden Methoden des Immun-Overlay Verfahrens und der Massenspektrometrie untersucht. Die strukturelle Charakterisierung kann in folgende Abschnitte unterteilt werden: - Optimierung des Dünnschichtchromatographie-Laufmittels für die Trennung von langkettigen Gangliosiden mit Poly-N-Acetyllaktosaminyl-Grundstrukturen, - Endoglykoceramidase Spaltung von HGG-Gangliosiden mit anschließender Trennung und Aufreinigung der Spaltprodukte, - Immun-Overlay Tests mit den sLe x-spezifischen monoklonalen Antikörpern CSLEX1 und KM93 sowie der E-Selektin-IgG Chimäre, - weitere Immun-Overlay Tests mit dem CDw65 Antikörper gegen VIM-2 und mit Antiseren gegen Ganglioside mit den terminalen isomeren Strukturen Neu5Ac[alpha]2-3Gal[beta]1-4GlcNAc-R und Neu5Ac[alpha]2-6Gal[beta]1-4GlcNAc-R, - Flüssigchromatographie (LC) und hochauflösende Flüssigchromatographie (HPLC) im präparativen Maßstab zur Gewinnung von mit sLe x-Gangliosiden angereicherten Fraktionen, - präparative Dünnschichtchromatographie und chromatographische Reinigung der erhaltenen Gangliosid-Einzelfraktionen, - Massenspektrometrie zur Strukturaufklärung der Gangliosid-Fraktionen. Neben der strukturellen Charakterisierung wurde als weitere Hauptaufgabe dieser Arbeit der funktionale Nachweis erbracht, dass E-Selektin-bindende Ganglioside auch mit E-Selektin-exprimierenden Zellen interagieren und dass die zelluläre Bindung durch die Wechselwirkung zwischen sLe x-Gangliosiden und dem Zelloberflächenmolekül E-Selektin bewirkt wird. Die auf der Gangliosid-E-Selektin-Bindung beruhende Adhäsion wurde hauptsächlich mit CHO-E Zellen nachgewiesen, die konstitutiv E-Selektin auf ihrer Oberfläche exprimieren. Für diesen funktionalen Nachweis wurden folgende Voraussetzungen geschaffen: 1. Entwicklung eines auf Mikrotiterplatten basierenden Testverfahrens, mit dem die Zelladhäsion an Gangliosid-Mischungen nachweisbar und quantifizierbar ist, und 2. Etablierung eines Zelladhäsionsverfahrens zur Detektion von Zellbindungen an HPTLC-getrennten Gangliosiden. Die Lokalisation gebundener Zellen erfolgte mit Antikörpern und unter Zuhilfenahme eines Viabilitätstestes. Für die Zelladhäsionsmethoden wurde ein Anwendungsspektrum erarbeitet, wobei die Leistungs- und Ausbaufähigkeit dieser Systeme aufgezeigt wurde durch (a) konzentrationsabhängige kompetitive Inhibition der E-Selektin-Bindung mit dem monoklonalen Antikörper CSLEX1, (b) enzymatische Desialylierung der Ganglioside mit einer Neuraminidase auf der HPTLC-Platte zur Unterdrückung der E-Selektin vermittelten Zelladhäsion, (c) Untersuchung des Gangliosid-Bindungsvermögens durch primäre Zellen (HUVEC), die das E-Selektin transient exprimieren. Mit den in dieser Arbeit durchgeführten biochemischen und zellkulturtechnischen Verfahren wurde der auf Strukturuntersuchungen und Funktionsstudien beruhende Nachweis erbracht, dass Ganglioside mit sLe x-Epitopen tatsächlich E-Selektin-Rezeptoren darstellen.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bielefeld

Year

2001

Author dc:creator

• Lümen, Regine

Repository record source_url

https://pub.uni-bielefeld.de/record/2304862

OAI identifier oai:identifier

oai:pub.uni-bielefeld.de:2304862