Die extrazelluläre Domäne der humanen Guanylatzyklase C und ihre Liganden: Rekombinante Expression, strukturelle Charakterisierung und Aktivitätsbestimmung

Die Wechselwirkung der intestinalen Guanylatzyklase C (GC-C) mit den Peptidhormonen Guanylin und Uroguanylin sowie dem bakteriellen hitzestabilen Enterotoxin STh ist von entscheidender Bedeutung für die Regulation des Elektrolyt- und Wasserhaushalts im Dünndarm. Guanylin, Uroguanylin und STh sind 15 bis 19 Aminosäuren lange, disulfidreiche Peptide. Ihre Bindung an die extrazelluläre Domäne (ECD) von GC-C führt zur Aktivierung von deren intrazellulärer katalytischer Guanlyatzyklasedomäne und resultiert in einer durch zyklisches Guanosin-3',5'-monophosphat (cGMP) vermittelten Sekretion von Anionen ins Darmlumen. Die Rolle der STh/GC‑C‑Interaktion bei der durch enterotoxigene Escherichia coli (ETEC) induzierten akuten sekretorischen Diarrhoe und die erst kürzlich gemachte Beobachtung, dass die Aktivierung von GC‑C durch ihre Liganden eine verminderte Inzidenz von kolorektalem Krebs nach sich zieht, machen GC-C zu einem vielversprechenden Ansatzpunkt innovativer Therapien. Um zum Verständnis der molekularen Grundlagen der Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung beizutragen und als Voraussetzung für weiterführende Bindungsstudien, wurden in dieser Arbeit effiziente Protokolle zur rekombinanten Expression und Reinigung der GC-C-Liganden Uroguanylin und STh entwickelt. Außerdem wurden mutierte Varianten beider Peptide exprimiert und charakterisiert. Des Weiteren wurden mehrere rekombinante Expressionssysteme, basierend auf Escherichia coli, der Hefe Pichia pastoris und Säugerzellen, auf ihre Eignung zur Expression der extrazellulären Rezeptordomäne von GC-C oder eines geeigneten, zur Ligandenbindung befähigten Rezeptorfragments hin untersucht. Guanylin und Uroguanylin werden in vivo als Prohormone exprimiert, wobei die Rolle des Propeptids darin besteht, die biologisch aktive Konformation der Hormonsequenz zu stabilisieren und die Ausbildung der nativen Disulfidverbrückung zu ermöglichen. Aus diesen Prohormonen werden die jeweiligen Hormone proteolytisch freigesetzt. In einem ersten Schritt wurde Uroguanylin hergestellt, indem das Vorläuferprotein Prouroguanylin rekombinant exprimiert, gereinigt und tryptisch verdaut wurde. Durch NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass das aus dem Spaltansatz gereinigte Peptid die gleichen chemischen Verschiebungen aufwies wie biologisch aktives Uroguanylin. Zusammen mit dem massenspektrometrischen Nachweis der beiden im Peptid enthaltenen Disulfidbrücken diente dies als Bestätigung, dass das gereinigte Uroguanylin die korrekte Konformation annahm. Zur rekombinanten Expression von biologisch aktivem hitzestabilem Enterotoxin STh wurde seine große strukturelle Ähnlichkeit zu Uroguanylin ausgenutzt und ein chimäres Vorläuferprotein, bestehend aus dem N-terminalen Propeptid von Prouroguanylin und der Aminosäuresequenz von STh, entwickelt. Dieses neue Fusionsprotein wurde Prouro-STh genannt. Analog zur Situation in Prouroguanylin, in der das Propeptid die Faltung von Uroguanylin und die Ausbildung der Disulfidbrücken ermöglicht, sollte auch innerhalb des Fusionsproteins Prouro-STh die Bildung des korrekten Disulfidverbrückungsmusters unterstützt werden. Rekombinantes STh konnte in guter Ausbeute und Reinheit isoliert und anschließend strukturell charakterisiert werden (Weiglmeier et al., 2013). Mit einem in‑vitro-Aktivitätsassay wurde die biologische Aktivität von beiden rekombinanten Peptiden, Uroguanylin und STh, nachgewiesen. Dass sich das in dieser Arbeit etablierte Expressionssystem auch zur Herstellung anderer, von Uroguanylin und STh abgeleiteter Agonisten der GC-C eignet, wurde durch die erfolgreiche Expression und Reinigung der Varianten Uroguanylin A3R D6E, STh L9Y und STh Y5R L9Y gezeigt. Das Propeptid toleriert die Punktmutationen innerhalb der Zielsequenz (Uroguanylin bzw. STh) ohne dass der Propeptid-unterstützte Faltungsmechanismus beeinträchtigt wäre. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde zunächst das Rezeptorfragment MiniGC-C, das mit einer Länge von 197 Aminosäuren der membrannahen Subdomäne der ECD entspricht, in E. coli exprimiert. MiniGC-C ist löslich und strukturiert und konnte in guter Ausbeute gereinigt werden. Jedoch wurde in NMR‑Titrationsexperimenten weder eine Wechselwirkung mit Uroguanylin noch mit STh beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Ligandenbindung entgegen anderslautender Voraussagen nicht ausschließlich von der membrannahen Subdomäne vermittelt wird. Zur Expression der gesamten extrazellulären Domäne von GC-C wurden Protokolle für E. coli, die methylotrophe Hefe Pichia pastoris sowie Säugerzellkultur entwickelt und evaluiert. Die beiden in E. coli exprimierten Konstrukte Trx-ECD-GC-C und NusA‑Cys‑‑ECD‑GC‑C waren aufgrund von minimaler Löslichkeit einerseits und offensichtlicher Fehlfaltung und Oligomerisierung andererseits nicht geeignet, die Liganden von GC-C zu binden. Die ECD von GC-C wurde in P. pastoris und in Säugerzellen exprimiert, jedoch waren in beiden Fällen die Ausbeuten der Expressionen nur sehr gering. Darüber hinaus unterlagen beide Konstrukte proteolytischem Abbau und konnten nach einigen Reinigungsschritten nicht mehr detektiert werden. Obwohl es in dieser Arbeit nicht möglich war, ein lösliches, strukturiertes und zur Ligandenbindung befähigtes Fragment von GC-C in reiner Form herzustellen, stellen die evaluierten Expressions- und Reinigungsprotokolle doch eine Grundlage für zukünftige Anstrengungen zum Erreichen dieses Ziels dar. Insbesondere ist hervorzuheben, dass mit der hier entwickelten relativ einfachen und kostengünstigen Methode zur Produktion und Isotopenmarkierung von Agonisten der GC-C, ein wichtiges Werkzeug für die NMR-spektroskopische Charakterisierung der Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung der GC-C zur Verfügung steht. Da außerdem das pharmakologische Potential von Uroguanylin- und STh-Varianten zunehmend in den Fokus der Forschung rückt, sind die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Ergebnisse ein wichtiger Beitrag zur Wirkstoffentwicklung.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2014

Author dc:creator

• Weiglmeier, Philipp Richard

Contributors dc:contributor

• Rösch, Paul

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/48/

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