Strukturelle und biochemische Charakterisierung der humanen löslichen Adenylyl-Cyclase

Cyclisches-3'-5'-Adenosinmonophosphat (cAMP) reguliert als evolutionär konservierter sekundärer Botenstoff ubiquitär verschiedene zelluläre Funktionen. In Säugern wird cAMP von neun transmembranen Adenylyl-Cyclasen (tmACs), aber nur eine lösliche Cyclase (sAC), synthetisiert. Ausschließlich die lösliche Adenylyl-Cyclase wird dabei durch Bicarbonat aktiviert und wirkt daher als zellulärer Sensor für Bicarbonat. Darüber hinaus reagiert die löslichen Adenylyl-Cyclase auf Änderungen der zellulären ATP Substratkonzentration, der Calciumkonzentrationen und des pH-Wertes. Die humane lösliche Adenylyl-Cyclase ist bereits biochemisch gut charakterisiert, jedoch konnten bisher nur bakterielle Homologe oder transmembrane Adenylyl-Cyclasen strukturell untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals Strukturen des katalytischen Zentrums der humanen löslichen Adenylyl-Cyclase in der apo-Form sowie in Komplex mit verschiedenen Liganden wie Substrat, Substratanalogon, Produkt oder Aktivator aufgeklärt. Die Bindung des Substrats erfolgt im ersten Schritt in einer losen ATP-Koordination in syn-Konformation, die durch divalente Ionen wie Calcium verbessert wird. Anschließend kommt es am N1-Stickstoff zur Erkennung der Purinbase durch das Lys334 in anti-Konformation des Nukleotide (Abb. 6.1). Die Möglichkeit für das Substrat zunächst in der syn-Konformation zu binden könnte die hohe Nebenaktivität erklären, da das Enzym hierbei auch GTP anstatt ATP erkennen kann. Die geringe Affinität des Substrats ATP zu hsAC im Vergleich zu transmembranen Adenylyl- oder Guanylyl-Cyclasen liegt in der unterschiedlichen Koordination des Ringsauerstoffs der Ribose begründet. Cyclasen mit einer hohen Substrataffinität interagieren über ein Serin oder Tyrosin mit dem Ringsauerstoff. In der hsAC hingegen ist diese Aminosäureposition durch ein Alanin (Ala415) ersetzt, welches den Ringsauerstoff nicht komplexieren kann. Die Affinität für ATP kann jedoch durch die Bindung von Ca2+ in der Ionenbindestelle B durch bessere Koordination der Phosphate erhöht werden. Das Arg416 ist für die Katalyse aufgrund seiner Position essentiell und übernimmt wahrscheinlich die Funktion die katalytische Base zu aktivieren. Bei der Katalyse bewegt sich das α-Phosphat in Richtung der Ribose. Die Freisetzung des Produkts Pyrophosphat (PPi) scheint der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Katalyse zu sein. Dies geht sowohl aus strukturellen Beobachtungen, als auch Affinitätsvergleichen hervor. Bicarbonat ist der bisher einzig bekannte physiologische Aktivator der humanen löslichen Adenylyl-Cyclase. Der Aktivator kann die hsAC durch direkte Bindung stimulieren und wird dabei durch Lys95 und Arg176 komplexiert. HCO3- initiiert durch Freigeben des Asp99 die Bildung der katalytischen Ionenbindestelle (Abb. 6.1). Darüber hinaus könnte Bicarbonat durch Bindung an den Produktkomplex eine Rolle bei der Produktfreisetzung spielen, da HCO3- die Affinität für PPi reduziert. Das Arg176 verbrückt dabei das regulatorische und das aktiven Zentrum miteinander (Abb. 6.1). Verschiedene pharmakologische Inhibitoren wurden auf ihre Wirkungsweise untersucht. Der hsAC selektive Inhibitor KH7 bindet kompetitiv zum Substrat an das Enzym, die genaue Bindestelle bleibt jedoch weiterhin unbekannt. 4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbendisulfonsäure (DIDS) hingegen inhibiert die hsAC durch Bindung im Zugang zum aktiven Zentrum und verhindert damit auch eine Aktivierung durch Bicarbonat. Zusätzlich wird das Arg176 blockiert, welches essentiell für die Bicarbonataktivierung ist. Zusammenfassend liefern diese Ergebnisse einen strukturellen Einblick in den molekularen Mechanismus der Katalyse sowie Erkenntnisse zur Regulation durch HCO3- und pharmakologischen Inhibitoren. Diese Informationen können nun für die weitere Entwicklung von isoformspezifischen Inhibitoren oder Aktivatoren genutzt werden.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2014

Author dc:creator

• Kleinbölting, Silke

Contributors dc:contributor

• Steegborn, Clemens

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/1768/

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