ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΣΥΝΕΧΟΥΣ ΚΑΙ ΔΙΑΚΟΠΤΟΜΕΝΗΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ ΣΤΗΝ ΠΕΡΙΟΧΗ ΤΟΥ ΜΠΛΕ ΣΕ IN VITRO ΜΟΝΤΕΛΟ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ

Οι χρόνιες πληγές χαρακτηρίζονται συχνά από ανεπαρκή ή παρατεταμένη αποκατάσταση των ιστών. Επομένως, καθίσταται περισσότερο αναγκαία από ποτέ η αναζήτηση νέων συμπληρωματικών θεραπειών που να επιταχύνουν την φυσιολογική διαδικασία της επούλωσης. Το μπλε φως αποτελεί μία αναδυόμενη προσέγγιση στον τομέα της φωτοθεραπείας. Πέρα από την τεκμηριωμένη αντιμικροβιακή του δράση, έχει συσχετιστεί με μεταβολές στη βιωσιμότητα, τη μετανάστευση και τη λειτουργία των κυττάρων που εμπλέκονται στην επούλωση. Η βιολογική του επίδραση δεν είναι σταθερή αλλά διαφοροποιείται ανάλογα με τις συνθήκες της ακτινοβόλησης. Παρ’ όλα αυτά, η σύγκριση συνεχών και διακοπτόμενων πρωτοκόλλων ακτινοβόλησης σε μοντέλα επούλωσης πληγών, είναι ένα πεδίο που δεν έχει διερευνηθεί ακόμη επαρκώς. Ο σκοπός της διπλωματικής είναι η διερεύνηση της διαδικασίας επούλωσης σε ένα in vitro μοντέλο τραύματος, υπό την επίδραση ακτινοβολίας στην περιοχή του μπλε (425 nm) η οποία χορηγήθηκε είτε με συνεχή είτε με διακοπτόμενη λειτουργία. Ειδικότερα, μελετήθηκε η επίδραση των παραμέτρων της διακοπτόμενης ακτινοβόλησης, όπως η διάρκεια των φωτεινών και σκοτεινών διαστημάτων (duty cycle) και η συχνότητα παλμών (frequency), με στόχο την κατανόηση της επίδρασης τους στην κυτταρική απόκριση και τον προσδιορισμό των συνθηκών ακτινοβόλησης που οδηγούν στη βέλτιστη κυτταρική απάντηση και στην αποτελεσματικότερη επούλωση. Ακόμα, μελετήθηκε η ενδοκυττάρια παραγωγή ελευθέρων ριζών (ROS), προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή συμμετοχή στους μηχανισμούς που διέπουν τη διαδικασία της επούλωσης. Για το σκοπό αυτό, στην παρούσα διπλωματική εργασία χρησιμοποιήθηκαν ΝΙΗ-3Τ3 ινοβλάστες κι εφαρμόστηκε μοντέλο επούλωσης scratch assay, ως αρχική in vitro προσέγγιση για την αξιολόγηση της σύγκλεισης του τραύματος. Πραγματοποιήθηκε ακτινοβόληση με πηγή φωτός LED στα 425 nm κι ακολούθησε λήψη φωτογραφιών στις 0, 24, 48 και 72 ώρες. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση εικόνας και υπολογίστηκε το ποσοστό της επούλωσης. Επιπρόσθετα, έγινε ποιοτική μελέτη των ROS αμέσως μετά την ακτινοβόληση, με τη χρήση διαλύματος CM-H2DCFDA. Δοκιμασία ΜΤΤ προηγήθηκε των ανωτέρω, για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Η ακτινοβόληση με μπλε φως στα 425 nm επηρέασε τόσο τη βιωσιμότητα των κυττάρων όσο και τη σύγκλειση της πληγής. Στη δοκιμασία ΜΤΤ, η ισχύς των 3 mW/cm2 διατήρησε τη βιωσιμότητα των ΝΙΗ-3T3 ινοβλαστών εντός αποδεκτών επιπέδων, ενώ η αύξηση της ισχύος και της διάρκειας έκθεσης, συνοδεύτηκε από μείωσή της. Τα αποτελέσματα από το scratch assay, έδειξαν ότι τα δείγματα με συνεχή ακτινοβόληση για 1 και 2 min, είχαν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό επούλωσης από τους μάρτυρες 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Μεταξύ των διακοπτόμενων πρωτοκόλλων, συνθήκες 1 min ON – 2 s OFF και 1 s OFF – 0,5 s OFF άγγιξαν τα υψηλότερα ποσοστά επούλωσης στις 24 ώρες, παρά τη σταθερή συνολική διάρκεια ΟΝ και την σταθερή ενεργειακή πυκνότητα. Επιπλέον, αρκετά από τα διακοπτόμενα πρωτόκολλα παρουσίασαν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό επούλωσης σε σχέση με τους μη ακτινοβολημένους μάρτυρες. Συνολικά, τα αποτελέσματα αναδεικνύουν ότι η απόκριση των NIH-3T3 ινοβλαστών στο μπλε φως εξαρτάται όχι μόνο από το μήκος κύματος και την ενεργειακή πυκνότητα, αλλά και από τη χρονική διαμόρφωση της ακτινοβόλησης. Ειδικότερα, η διάρκεια του παλμού, η συχνότητα, το duty cycle και κυρίως η ισορροπία μεταξύ των περιόδων ON και OFF φαίνεται να αποτελούν κρίσιμες παραμέτρους που διαμορφώνουν τη βιολογική απόκριση. Τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι στα πρωτόκολλα μεγάλης διάρκειας παλμού, η επαρκής περίοδος OFF ενδέχεται να επιτρέπει τη μερική αποκατάσταση των κυτταρικών διεργασιών μεταξύ διαδοχικών κύκλων φωτοδιέγερσης, ενώ στα πρωτόκολλα μικρής διάρκειας παλμού τα συχνά και σύντομα ερεθίσματα ενδέχεται να διατηρούν τη φωτοβιολογική ενεργοποίηση χωρίς παρατεταμένη συνεχή διέγερση. Η ισορροπία μεταξύ των περιόδων ON και OFF είναι πιθανό να επηρεάζει τη χρονική αλληλουχία ενεργοποίησης και απενεργοποίησης φωτοευαίσθητων ενδοκυττάριων μονοπατιών, οδηγώντας σε διαφορετικές βιολογικές αποκρίσεις ακόμη και όταν η συνολική διάρκεια ON και η ενεργειακή πυκνότητα παραμένουν σταθερές. Η παραγωγή των ROS μελετήθηκε ποιοτικά στην ομάδα ελέγχου, στη συνεχή ακτινοβόληση των 3 min και σε διακοπτόμενα πρωτόκολλα με χαμηλά, ενδιάμεσα και υψηλά ποσοστά επούλωσης. Εντονότερο σήμα φθορισμού καταγράφηκε στις συνθήκες με χαμηλότερο ποσοστό σύγκλεισης της πληγής, ενώ τα πρωτόκολλα με υψηλότερο ποσοστό επούλωσης, εμφάνισαν ασθενέστερο σήμα. Ίδιες ρυθμίσεις απεικόνισης διατηρήθηκαν σε όλες τις ομάδες για να διασφαλιστεί η σύγκριση των εικόνων. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι η χρονική διαμόρφωση της ακτινοβόλησης επηρεάζει την ενδοκυττάρια παραγωγή ROS και ότι η υπερβολική παραγωγή ROS ενδέχεται να σχετίζεται με μειωμένη κυτταρική μετανάστευση και μικρότερη σύγκλειση του τραύματος. Συμπερασματικά, τα ευρήματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η βιολογική απόκριση των NIH-3T3 ινοβλαστών στο μπλε φως καθορίζεται όχι μόνο από την ενεργειακή δόση αλλά και από τη χρονική κατανομή της ακτινοβόλησης. Η συστηματική διερεύνηση διαφορετικών συνδυασμών ON και OFF περιόδων μπορεί να συμβάλει στον ακριβέστερο σχεδιασμό πρωτοκόλλων φωτοβιοτροποποίησης για εφαρμογές στην επούλωση τραυμάτων.

Authors dc:creator

• ΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΥ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ
• PETROPOULOU KONSTANTINA

• Θετικές Επιστήμες
• Science

Language dc:language

Ελληνικά, Greek, English

Identifier

uoadl:5426607

OAI record oai:identifier

https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/frontend/oaipmh?verb=GetRecord&metadataPrefix=oai_dc&identifier=oai%3Alib.uoa.gr%3Auoadl%3A5426607