Μελέτη του βασιδιομύκητα Amanita muscaria για την έκφραση γονιδίων και παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών για φαρμακολογική αξιοποίηση

Η μουσκιμόλη αποτελεί ένα φυσικό ισοξαζολικό αλκαλοειδές με νευροδραστικές ιδιότητες, το οποίο παράγεται από τον εκτομυκορριζικό βασιδιομύκητα Amanita muscaria και δρα ως ισχυρός αγωνιστής των υποδοχέων GABA-α και GABA-γ. Μαζί με τον πρόδρομο μεταβολίτη της, το ιβοτενικό οξύ, έχει αποτελέσει τόσο εργαλείο στη βασική νευροβιολογική έρευνα, όσο και αντικείμενο εκτεταμένης φαρμακολογικής έρευνας την τελευταία δεκαετία, λόγω των έντονων βιολογικών δράσεών της, καθώς και της αξιοποίησής της ως μοριακό σκελετό (scaffold) για τη σύνθεση φαρμακευτικών αναλόγων με νευροπροστατευτική, κυρίως αντιεπιληπτική, δράση. Παρότι οι δύο αυτές ενώσεις έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί χημικά εδώ και αρκετές δεκαετίες, το βιοσυνθετικό τους μονοπάτι παρέμεινε σε μεγάλο βαθμό άγνωστο έως πρόσφατα. Το 2020 προτάθηκε για πρώτη φορά ένα υποθετικό βιοσυνθετικό μονοπάτι παραγωγής του ιβοτενικού οξέος και της μουσκιμόλης, βασισμένο σε επτά γονίδια (iboH, iboA, iboF, iboG1, iboG2, iboC και iboD) που συγκροτούν ένα μη-κανονικό biosynthetic gene cluster (BGC) στο γονιδίωμα του A. muscaria. Ωστόσο, μέχρι σήμερα μόνο η λειτουργία του πρώτου γονιδίου του μονοπατιού (iboH) έχει επιβεβαιωθεί πειραματικά, ενώ η εμπλοκή των υπολοίπων γονιδίων παραμένει σε μεγάλο βαθμό υποθετική. Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε διερεύνηση της λειτουργίας του προτεινόμενου ibo βιοσυνθετικού συμπλέγματος μέσω ανακατασκευής και ετερόλογης έκφρασης του μονοπατιού στον μύκητα Saccharomyces cerevisiae. Η επιλογή του S. cerevisiae ως οργανισμού-μοντέλου βασίστηκε στην εκτενή γενετική του εργαλειοθήκη, στην ευκολία καλλιέργειας και γενετικού χειρισμού, καθώς και στην ευρεία χρήση του ως κυτταρικού εργοστασίου για την παραγωγή φυσικών προϊόντων μέσω μεταβολικής μηχανικής. Για τον σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν και κατασκευάστηκαν τρεις κασέτες έκφρασης που έφεραν διαφορετικούς συνδυασμούς των γονιδίων του ibo συμπλέγματος (HDC, G1F, G2A κασέτες), χρησιμοποιώντας ως «διακόπτη» του μονοπατιού τον επαγώγιμο GAL1 υποκινητή για την έκφραση του πρώτου γονιδίου, iboH, και ισχυρούς συνεχείς υποκινητές για τα υπόλοιπα ibo γονίδια. Oι κασέτες εισήχθησαν στο γονιδίωμα του S. cerevisiae μέσω στοχευμένης αντικατάστασης των γονιδιακών τόπων UGA4, PUT4 και GAP1 με τη χρήση του συστήματος CRISPR-Cas9. Η έκφραση των γονιδίων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση RT-qPCR έξι ώρες μετά την επαγωγή με γαλακτόζη. Για τη διερεύνηση της παραγωγής των αναμενόμενων μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε ανάλυση εκχυλισμάτων από το τελικό γενετικά τροποποιημένο στέλεχος ζύμης στις χρονικές στιγμές των 6, 12 και 24 ωρών μετά την επαγωγή, με Υγρή Χρωματογραφία- Φασματομετρία μάζας (LC-MS). Τα αποτελέσματα δεν κατέδειξαν παραγωγή ούτε ιβοτενικού οξέος ούτε μουσκιμόλης. Ως εκ τούτου, επόμενο βήμα αποτελεί η αναζήτηση και ταυτοποίηση πιθανών ενδιάμεσων μεταβολιτών, με στόχο τον εντοπισμό του σημείου στο οποίο διακόπτεται η ροή του βιοσυνθετικού μονοπατιού (metabolic bottleneck). Επιπλέον, νεότερα δεδομένα που προέκυψαν από την αλληλούχηση του στελέχους Amanita muscaria ATHUM10505 (το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως πηγή για την αρχική απομόνωση των προς κλωνοποίηση ibo γονιδίων), έδειξαν ότι η αλληλουχία του κλωνοποιημένου γονιδίου iboC αντιστοιχεί σε γονίδιο εκτός του συμπλέγματος, με περίπου 80% ομοιότητα προς το iboC που εντοπίζεται εντός του ibo BGC. Το εύρημα αυτό ενδέχεται να αποτελεί μία πιθανή εξήγηση για τη μη ανίχνευση των τελικών προϊόντων του μονοπατιού.

Authors dc:creator

• ΠΟΔΗΜΑΤΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ-ΝΕΦΕΛΗ
• PODIMATA KONSTANTINA-NEFELI

• Θετικές Επιστήμες
• Science

Language dc:language

Ελληνικά, Greek

Identifier

uoadl:5425793

OAI record oai:identifier

https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/frontend/oaipmh?verb=GetRecord&metadataPrefix=oai_dc&identifier=oai%3Alib.uoa.gr%3Auoadl%3A5425793