{"id":{"repo_id":"athens","oai_identifier":"oai:lib.uoa.gr:uoadl:5425793"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/athens/oai:lib.uoa.gr:uoadl:5425793","repository":{"repo_id":"athens","name":"National and Kapodistrian University of Athens","base_url":"https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/frontend/oaipmh"},"display":{"title":"Μελέτη του βασιδιομύκητα Amanita muscaria για την έκφραση γονιδίων και παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών για φαρμακολογική αξιοποίηση","abstract":"Η μουσκιμόλη αποτελεί ένα φυσικό ισοξαζολικό αλκαλοειδές με νευροδραστικές ιδιότητες, το οποίο παράγεται από τον εκτομυκορριζικό βασιδιομύκητα Amanita muscaria και δρα ως ισχυρός αγωνιστής των υποδοχέων GABA-α και GABA-γ. Μαζί με τον πρόδρομο μεταβολίτη της, το ιβοτενικό οξύ, έχει αποτελέσει τόσο εργαλείο στη βασική νευροβιολογική έρευνα, όσο και αντικείμενο εκτεταμένης φαρμακολογικής έρευνας την τελευταία δεκαετία, λόγω των έντονων βιολογικών δράσεών της, καθώς και της αξιοποίησής της ως μοριακό σκελετό (scaffold) για τη σύνθεση φαρμακευτικών αναλόγων με νευροπροστατευτική, κυρίως αντιεπιληπτική, δράση. Παρότι οι δύο αυτές ενώσεις έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί χημικά εδώ και αρκετές δεκαετίες, το βιοσυνθετικό τους μονοπάτι παρέμεινε σε μεγάλο βαθμό άγνωστο έως πρόσφατα. Το 2020 προτάθηκε για πρώτη φορά ένα υποθετικό βιοσυνθετικό μονοπάτι παραγωγής του ιβοτενικού οξέος και της μουσκιμόλης, βασισμένο σε επτά γονίδια (iboH, iboA, iboF, iboG1, iboG2, iboC και iboD) που συγκροτούν ένα μη-κανονικό biosynthetic gene cluster (BGC) στο γονιδίωμα του A. muscaria. Ωστόσο, μέχρι σήμερα μόνο η λειτουργία του πρώτου γονιδίου του μονοπατιού (iboH) έχει επιβεβαιωθεί πειραματικά, ενώ η εμπλοκή των υπολοίπων γονιδίων παραμένει σε μεγάλο βαθμό υποθετική. Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε διερεύνηση της λειτουργίας του προτεινόμενου ibo βιοσυνθετικού συμπλέγματος μέσω ανακατασκευής και ετερόλογης έκφρασης του μονοπατιού στον μύκητα Saccharomyces cerevisiae. Η επιλογή του S. cerevisiae ως οργανισμού-μοντέλου βασίστηκε στην εκτενή γενετική του εργαλειοθήκη, στην ευκολία καλλιέργειας και γενετικού χειρισμού, καθώς και στην ευρεία χρήση του ως κυτταρικού εργοστασίου για την παραγωγή φυσικών προϊόντων μέσω μεταβολικής μηχανικής. Για τον σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν και κατασκευάστηκαν τρεις κασέτες έκφρασης που έφεραν διαφορετικούς συνδυασμούς των γονιδίων του ibo συμπλέγματος (HDC, G1F, G2A κασέτες), χρησιμοποιώντας ως «διακόπτη» του μονοπατιού τον επαγώγιμο GAL1 υποκινητή για την έκφραση του πρώτου γονιδίου, iboH, και ισχυρούς συνεχείς υποκινητές για τα υπόλοιπα ibo γονίδια. Oι κασέτες εισήχθησαν στο γονιδίωμα του S. cerevisiae μέσω στοχευμένης αντικατάστασης των γονιδιακών τόπων UGA4, PUT4 και GAP1 με τη χρήση του συστήματος CRISPR-Cas9. Η έκφραση των γονιδίων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση RT-qPCR έξι ώρες μετά την επαγωγή με γαλακτόζη. Για τη διερεύνηση της παραγωγής των αναμενόμενων μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε ανάλυση εκχυλισμάτων από το τελικό γενετικά τροποποιημένο στέλεχος ζύμης στις χρονικές στιγμές των 6, 12 και 24 ωρών μετά την επαγωγή, με Υγρή Χρωματογραφία- Φασματομετρία μάζας (LC-MS). Τα αποτελέσματα δεν κατέδειξαν παραγωγή ούτε ιβοτενικού οξέος ούτε μουσκιμόλης. Ως εκ τούτου, επόμενο βήμα αποτελεί η αναζήτηση και ταυτοποίηση πιθανών ενδιάμεσων μεταβολιτών, με στόχο τον εντοπισμό του σημείου στο οποίο διακόπτεται η ροή του βιοσυνθετικού μονοπατιού (metabolic bottleneck). Επιπλέον, νεότερα δεδομένα που προέκυψαν από την αλληλούχηση του στελέχους Amanita muscaria ATHUM10505 (το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως πηγή για την αρχική απομόνωση των προς κλωνοποίηση ibo γονιδίων), έδειξαν ότι η αλληλουχία του κλωνοποιημένου γονιδίου iboC αντιστοιχεί σε γονίδιο εκτός του συμπλέγματος, με περίπου 80% ομοιότητα προς το iboC που εντοπίζεται εντός του ibo BGC. Το εύρημα αυτό ενδέχεται να αποτελεί μία πιθανή εξήγηση για τη μη ανίχνευση των τελικών προϊόντων του μονοπατιού.","abstract_html":"Η μουσκιμόλη αποτελεί ένα φυσικό ισοξαζολικό αλκαλοειδές με νευροδραστικές ιδιότητες, το οποίο παράγεται από τον εκτομυκορριζικό βασιδιομύκητα Amanita muscaria και δρα ως ισχυρός αγωνιστής των υποδοχέων GABA-α και GABA-γ. Μαζί με τον πρόδρομο μεταβολίτη της, το ιβοτενικό οξύ, έχει αποτελέσει τόσο εργαλείο στη βασική νευροβιολογική έρευνα, όσο και αντικείμενο εκτεταμένης φαρμακολογικής έρευνας την τελευταία δεκαετία, λόγω των έντονων βιολογικών δράσεών της, καθώς και της αξιοποίησής της ως μοριακό σκελετό (scaffold) για τη σύνθεση φαρμακευτικών αναλόγων με νευροπροστατευτική, κυρίως αντιεπιληπτική, δράση. Παρότι οι δύο αυτές ενώσεις έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί χημικά εδώ και αρκετές δεκαετίες, το βιοσυνθετικό τους μονοπάτι παρέμεινε σε μεγάλο βαθμό άγνωστο έως πρόσφατα. Το 2020 προτάθηκε για πρώτη φορά ένα υποθετικό βιοσυνθετικό μονοπάτι παραγωγής του ιβοτενικού οξέος και της μουσκιμόλης, βασισμένο σε επτά γονίδια (iboH, iboA, iboF, iboG1, iboG2, iboC και iboD) που συγκροτούν ένα μη-κανονικό biosynthetic gene cluster (BGC) στο γονιδίωμα του A. muscaria. Ωστόσο, μέχρι σήμερα μόνο η λειτουργία του πρώτου γονιδίου του μονοπατιού (iboH) έχει επιβεβαιωθεί πειραματικά, ενώ η εμπλοκή των υπολοίπων γονιδίων παραμένει σε μεγάλο βαθμό υποθετική. Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε διερεύνηση της λειτουργίας του προτεινόμενου ibo βιοσυνθετικού συμπλέγματος μέσω ανακατασκευής και ετερόλογης έκφρασης του μονοπατιού στον μύκητα Saccharomyces cerevisiae. Η επιλογή του S. cerevisiae ως οργανισμού-μοντέλου βασίστηκε στην εκτενή γενετική του εργαλειοθήκη, στην ευκολία καλλιέργειας και γενετικού χειρισμού, καθώς και στην ευρεία χρήση του ως κυτταρικού εργοστασίου για την παραγωγή φυσικών προϊόντων μέσω μεταβολικής μηχανικής. Για τον σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν και κατασκευάστηκαν τρεις κασέτες έκφρασης που έφεραν διαφορετικούς συνδυασμούς των γονιδίων του ibo συμπλέγματος (HDC, G1F, G2A κασέτες), χρησιμοποιώντας ως «διακόπτη» του μονοπατιού τον επαγώγιμο GAL1 υποκινητή για την έκφραση του πρώτου γονιδίου, iboH, και ισχυρούς συνεχείς υποκινητές για τα υπόλοιπα ibo γονίδια. Oι κασέτες εισήχθησαν στο γονιδίωμα του S. cerevisiae μέσω στοχευμένης αντικατάστασης των γονιδιακών τόπων UGA4, PUT4 και GAP1 με τη χρήση του συστήματος CRISPR-Cas9. Η έκφραση των γονιδίων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση RT-qPCR έξι ώρες μετά την επαγωγή με γαλακτόζη. Για τη διερεύνηση της παραγωγής των αναμενόμενων μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε ανάλυση εκχυλισμάτων από το τελικό γενετικά τροποποιημένο στέλεχος ζύμης στις χρονικές στιγμές των 6, 12 και 24 ωρών μετά την επαγωγή, με Υγρή Χρωματογραφία- Φασματομετρία μάζας (LC-MS). Τα αποτελέσματα δεν κατέδειξαν παραγωγή ούτε ιβοτενικού οξέος ούτε μουσκιμόλης. Ως εκ τούτου, επόμενο βήμα αποτελεί η αναζήτηση και ταυτοποίηση πιθανών ενδιάμεσων μεταβολιτών, με στόχο τον εντοπισμό του σημείου στο οποίο διακόπτεται η ροή του βιοσυνθετικού μονοπατιού (metabolic bottleneck). Επιπλέον, νεότερα δεδομένα που προέκυψαν από την αλληλούχηση του στελέχους Amanita muscaria ATHUM10505 (το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως πηγή για την αρχική απομόνωση των προς κλωνοποίηση ibo γονιδίων), έδειξαν ότι η αλληλουχία του κλωνοποιημένου γονιδίου iboC αντιστοιχεί σε γονίδιο εκτός του συμπλέγματος, με περίπου 80% ομοιότητα προς το iboC που εντοπίζεται εντός του ibo BGC. Το εύρημα αυτό ενδέχεται να αποτελεί μία πιθανή εξήγηση για τη μη ανίχνευση των τελικών προϊόντων του μονοπατιού.","abstract_has_math":false,"creators":["ΠΟΔΗΜΑΤΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ-ΝΕΦΕΛΗ","PODIMATA KONSTANTINA-NEFELI"],"institution":null,"degree_name":null,"degree_level":null,"degree_discipline":null,"degree_department":null,"school":null,"contributors":[],"advisors":[],"committee_chairs":[],"committee_members":[],"year":2026,"date_issued":"2026","date_published":"2026","updated_at":"2026-08-21T16:41:59Z","subjects":["Θετικές Επιστήμες","Science"],"languages":["Ελληνικά","Greek"],"rights":[],"rights_urls":[],"identifier_entries":[{"key":"dc:identifier","label":"Identifier","values":["uoadl:5425793"],"render_values":[{"text":"uoadl:5425793","href":null,"code":true}]}]},"links":{"outbound_url":"https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/5425793","outbound_label":"Repository record","outbound_source":"dc:identifier"},"source_record":{"url":"https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/frontend/oaipmh?verb=GetRecord&metadataPrefix=oai_dc&identifier=oai%3Alib.uoa.gr%3Auoadl%3A5425793","prefix":"oai_dc"},"metadata_groups":[{"id":"people","label":"People","entries":[{"key":"dc:creator","label":"Author","values":["ΠΟΔΗΜΑΤΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ-ΝΕΦΕΛΗ","PODIMATA KONSTANTINA-NEFELI"]}]},{"id":"academic_context","label":"Academic Context","entries":[{"key":"dc:date","label":"Dc Date","values":["2026"]},{"key":"dc:type","label":"Dc Type","values":["born_digital_postgraduate_thesis","Διπλωματική Εργασία","Postgraduate Thesis"]}]},{"id":"subjects_keywords","label":"Subjects and Keywords","entries":[{"key":"dc:subject","label":"Dc Subject","values":["Θετικές Επιστήμες","Science"]}]},{"id":"language_rights","label":"Language and Rights","entries":[{"key":"dc:language","label":"Dc Language","values":["Ελληνικά","Greek"]}]},{"id":"identifiers","label":"Identifiers","entries":[{"key":"dc:identifier","label":"Identifier","values":["uoadl:5425793","https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/5425793"]}]},{"id":"additional","label":"Additional Metadata","entries":[{"key":"dc:description","label":"Description","values":["Η μουσκιμόλη αποτελεί ένα φυσικό ισοξαζολικό αλκαλοειδές με νευροδραστικές ιδιότητες, το οποίο παράγεται από τον εκτομυκορριζικό βασιδιομύκητα Amanita muscaria και δρα ως ισχυρός αγωνιστής των υποδοχέων GABA-α και GABA-γ. Μαζί με τον πρόδρομο μεταβολίτη της, το ιβοτενικό οξύ, έχει αποτελέσει τόσο εργαλείο στη βασική νευροβιολογική έρευνα, όσο και αντικείμενο εκτεταμένης φαρμακολογικής έρευνας την τελευταία δεκαετία, λόγω των έντονων βιολογικών δράσεών της, καθώς και της αξιοποίησής της ως μοριακό σκελετό (scaffold) για τη σύνθεση φαρμακευτικών αναλόγων με νευροπροστατευτική, κυρίως αντιεπιληπτική, δράση. Παρότι οι δύο αυτές ενώσεις έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί χημικά εδώ και αρκετές δεκαετίες, το βιοσυνθετικό τους μονοπάτι παρέμεινε σε μεγάλο βαθμό άγνωστο έως πρόσφατα. Το 2020 προτάθηκε για πρώτη φορά ένα υποθετικό βιοσυνθετικό μονοπάτι παραγωγής του ιβοτενικού οξέος και της μουσκιμόλης, βασισμένο σε επτά γονίδια (iboH, iboA, iboF, iboG1, iboG2, iboC και iboD) που συγκροτούν ένα μη-κανονικό biosynthetic gene cluster (BGC) στο γονιδίωμα του A. muscaria. Ωστόσο, μέχρι σήμερα μόνο η λειτουργία του πρώτου γονιδίου του μονοπατιού (iboH) έχει επιβεβαιωθεί πειραματικά, ενώ η εμπλοκή των υπολοίπων γονιδίων παραμένει σε μεγάλο βαθμό υποθετική. Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε διερεύνηση της λειτουργίας του προτεινόμενου ibo βιοσυνθετικού συμπλέγματος μέσω ανακατασκευής και ετερόλογης έκφρασης του μονοπατιού στον μύκητα Saccharomyces cerevisiae. Η επιλογή του S. cerevisiae ως οργανισμού-μοντέλου βασίστηκε στην εκτενή γενετική του εργαλειοθήκη, στην ευκολία καλλιέργειας και γενετικού χειρισμού, καθώς και στην ευρεία χρήση του ως κυτταρικού εργοστασίου για την παραγωγή φυσικών προϊόντων μέσω μεταβολικής μηχανικής. Για τον σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν και κατασκευάστηκαν τρεις κασέτες έκφρασης που έφεραν διαφορετικούς συνδυασμούς των γονιδίων του ibo συμπλέγματος (HDC, G1F, G2A κασέτες), χρησιμοποιώντας ως «διακόπτη» του μονοπατιού τον επαγώγιμο GAL1 υποκινητή για την έκφραση του πρώτου γονιδίου, iboH, και ισχυρούς συνεχείς υποκινητές για τα υπόλοιπα ibo γονίδια. Oι κασέτες εισήχθησαν στο γονιδίωμα του S. cerevisiae μέσω στοχευμένης αντικατάστασης των γονιδιακών τόπων UGA4, PUT4 και GAP1 με τη χρήση του συστήματος CRISPR-Cas9. Η έκφραση των γονιδίων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση RT-qPCR έξι ώρες μετά την επαγωγή με γαλακτόζη. Για τη διερεύνηση της παραγωγής των αναμενόμενων μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε ανάλυση εκχυλισμάτων από το τελικό γενετικά τροποποιημένο στέλεχος ζύμης στις χρονικές στιγμές των 6, 12 και 24 ωρών μετά την επαγωγή, με Υγρή Χρωματογραφία- Φασματομετρία μάζας (LC-MS). Τα αποτελέσματα δεν κατέδειξαν παραγωγή ούτε ιβοτενικού οξέος ούτε μουσκιμόλης. Ως εκ τούτου, επόμενο βήμα αποτελεί η αναζήτηση και ταυτοποίηση πιθανών ενδιάμεσων μεταβολιτών, με στόχο τον εντοπισμό του σημείου στο οποίο διακόπτεται η ροή του βιοσυνθετικού μονοπατιού (metabolic bottleneck). Επιπλέον, νεότερα δεδομένα που προέκυψαν από την αλληλούχηση του στελέχους Amanita muscaria ATHUM10505 (το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως πηγή για την αρχική απομόνωση των προς κλωνοποίηση ibo γονιδίων), έδειξαν ότι η αλληλουχία του κλωνοποιημένου γονιδίου iboC αντιστοιχεί σε γονίδιο εκτός του συμπλέγματος, με περίπου 80% ομοιότητα προς το iboC που εντοπίζεται εντός του ibo BGC. Το εύρημα αυτό ενδέχεται να αποτελεί μία πιθανή εξήγηση για τη μη ανίχνευση των τελικών προϊόντων του μονοπατιού.","Muscimol is a naturally occurring isoxazole alkaloid with neuroactive properties, produced by the ectomycorrhizal basidiomycete Amanita muscaria, and acts as a potent agonist of GABA-a and GABA-c receptors. Together with its precursor metabolite, ibotenic acid, it has served both as a tool in fundamental neurobiological research and as a subject of extensive pharmacological investigation over the past decade, due to its strong biological activities and its use as a molecular scaffold for the synthesis of pharmaceutical analogues with neuroprotective, primarily anticonvulsant, properties. Although both compounds have been chemically isolated and characterized for several decades, their biosynthetic pathway remained largely unknown until recently. In 2020, a putative biosynthetic pathway for the production of ibotenic acid and muscimol was proposed for the first time, based on seven genes (iboH, iboA, iboF, iboG1, iboG2, iboC, and iboD) that form a non-canonical biosynthetic gene cluster (BGC) in the genome of A. muscaria. However, to date, only the function of the first gene in the pathway (iboH) has been experimentally validated, while the roles of the remaining genes remain largely hypothetical. In the present thesis, the function of the proposed ibo biosynthetic gene cluster (BGC) was investigated through the reconstruction and heterologous expression of the pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The selection of S. cerevisiae as a model organism was based on its extensive genetic toolbox, ease of cultivation and genetic manipulation, as well as its widespread use as a microbial cell factory to produce natural products through metabolic engineering approaches. To this end, three expression cassettes carrying different combinations of ibo cluster genes (HDC, G1F, and G2A cassettes) were designed and constructed. The inducible GAL1 promoter was employed as a pathway “switch” to control the expression of the first gene of the cluster, i.e., the iboH gene, while strong constitutive promoters were used for the expression of the remaining ibo genes. The cassettes were subsequently integrated into the S. cerevisiae genome through targeted replacement of the UGA4, PUT4, and GAP1 loci using the CRISPR-Cas9 system. Expression of the ibo genes was confirmed by RT-qPCR analysis six hours post-galactose induction. To investigate metabolite production, extracts from the final engineered yeast strain were analyzed at 6, 12, and 24 hours post-galactose induction using Liquid Chromatography- Mass Spectrometry (LC-MS). The results did not demonstrate the production of either ibotenic acid or muscimol. Therefore, the identification and characterization of potential pathway intermediates constitute the next step toward determining the metabolic bottleneck responsible for the interruption of pathway flux. Furthermore, recent whole genome sequencing data obtained from the Amanita muscaria ATHUM10505 strain, which served as the source strain of the cloned ibo genes, revealed that the sequence of the cloned iboC gene corresponds to an extra-cluster likely paralogous gene exhibiting approximately 80% sequence similarity to the iboC gene located within the ibo BGC. This finding may provide a possible explanation for the failure to detect the final pathway products."]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Μελέτη του βασιδιομύκητα Amanita muscaria για την έκφραση γονιδίων και παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών για φαρμακολογική αξιοποίηση"]}]}],"canonical_facts":{"dc:creator":["ΠΟΔΗΜΑΤΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ-ΝΕΦΕΛΗ","PODIMATA KONSTANTINA-NEFELI"],"dc:date":["2026"],"dc:description":["Η μουσκιμόλη αποτελεί ένα φυσικό ισοξαζολικό αλκαλοειδές με νευροδραστικές ιδιότητες, το οποίο παράγεται από τον εκτομυκορριζικό βασιδιομύκητα Amanita muscaria και δρα ως ισχυρός αγωνιστής των υποδοχέων GABA-α και GABA-γ. Μαζί με τον πρόδρομο μεταβολίτη της, το ιβοτενικό οξύ, έχει αποτελέσει τόσο εργαλείο στη βασική νευροβιολογική έρευνα, όσο και αντικείμενο εκτεταμένης φαρμακολογικής έρευνας την τελευταία δεκαετία, λόγω των έντονων βιολογικών δράσεών της, καθώς και της αξιοποίησής της ως μοριακό σκελετό (scaffold) για τη σύνθεση φαρμακευτικών αναλόγων με νευροπροστατευτική, κυρίως αντιεπιληπτική, δράση. Παρότι οι δύο αυτές ενώσεις έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί χημικά εδώ και αρκετές δεκαετίες, το βιοσυνθετικό τους μονοπάτι παρέμεινε σε μεγάλο βαθμό άγνωστο έως πρόσφατα. Το 2020 προτάθηκε για πρώτη φορά ένα υποθετικό βιοσυνθετικό μονοπάτι παραγωγής του ιβοτενικού οξέος και της μουσκιμόλης, βασισμένο σε επτά γονίδια (iboH, iboA, iboF, iboG1, iboG2, iboC και iboD) που συγκροτούν ένα μη-κανονικό biosynthetic gene cluster (BGC) στο γονιδίωμα του A. muscaria. Ωστόσο, μέχρι σήμερα μόνο η λειτουργία του πρώτου γονιδίου του μονοπατιού (iboH) έχει επιβεβαιωθεί πειραματικά, ενώ η εμπλοκή των υπολοίπων γονιδίων παραμένει σε μεγάλο βαθμό υποθετική. Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε διερεύνηση της λειτουργίας του προτεινόμενου ibo βιοσυνθετικού συμπλέγματος μέσω ανακατασκευής και ετερόλογης έκφρασης του μονοπατιού στον μύκητα Saccharomyces cerevisiae. Η επιλογή του S. cerevisiae ως οργανισμού-μοντέλου βασίστηκε στην εκτενή γενετική του εργαλειοθήκη, στην ευκολία καλλιέργειας και γενετικού χειρισμού, καθώς και στην ευρεία χρήση του ως κυτταρικού εργοστασίου για την παραγωγή φυσικών προϊόντων μέσω μεταβολικής μηχανικής. Για τον σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν και κατασκευάστηκαν τρεις κασέτες έκφρασης που έφεραν διαφορετικούς συνδυασμούς των γονιδίων του ibo συμπλέγματος (HDC, G1F, G2A κασέτες), χρησιμοποιώντας ως «διακόπτη» του μονοπατιού τον επαγώγιμο GAL1 υποκινητή για την έκφραση του πρώτου γονιδίου, iboH, και ισχυρούς συνεχείς υποκινητές για τα υπόλοιπα ibo γονίδια. Oι κασέτες εισήχθησαν στο γονιδίωμα του S. cerevisiae μέσω στοχευμένης αντικατάστασης των γονιδιακών τόπων UGA4, PUT4 και GAP1 με τη χρήση του συστήματος CRISPR-Cas9. Η έκφραση των γονιδίων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση RT-qPCR έξι ώρες μετά την επαγωγή με γαλακτόζη. Για τη διερεύνηση της παραγωγής των αναμενόμενων μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε ανάλυση εκχυλισμάτων από το τελικό γενετικά τροποποιημένο στέλεχος ζύμης στις χρονικές στιγμές των 6, 12 και 24 ωρών μετά την επαγωγή, με Υγρή Χρωματογραφία- Φασματομετρία μάζας (LC-MS). Τα αποτελέσματα δεν κατέδειξαν παραγωγή ούτε ιβοτενικού οξέος ούτε μουσκιμόλης. Ως εκ τούτου, επόμενο βήμα αποτελεί η αναζήτηση και ταυτοποίηση πιθανών ενδιάμεσων μεταβολιτών, με στόχο τον εντοπισμό του σημείου στο οποίο διακόπτεται η ροή του βιοσυνθετικού μονοπατιού (metabolic bottleneck). Επιπλέον, νεότερα δεδομένα που προέκυψαν από την αλληλούχηση του στελέχους Amanita muscaria ATHUM10505 (το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως πηγή για την αρχική απομόνωση των προς κλωνοποίηση ibo γονιδίων), έδειξαν ότι η αλληλουχία του κλωνοποιημένου γονιδίου iboC αντιστοιχεί σε γονίδιο εκτός του συμπλέγματος, με περίπου 80% ομοιότητα προς το iboC που εντοπίζεται εντός του ibo BGC. Το εύρημα αυτό ενδέχεται να αποτελεί μία πιθανή εξήγηση για τη μη ανίχνευση των τελικών προϊόντων του μονοπατιού.","Muscimol is a naturally occurring isoxazole alkaloid with neuroactive properties, produced by the ectomycorrhizal basidiomycete Amanita muscaria, and acts as a potent agonist of GABA-a and GABA-c receptors. Together with its precursor metabolite, ibotenic acid, it has served both as a tool in fundamental neurobiological research and as a subject of extensive pharmacological investigation over the past decade, due to its strong biological activities and its use as a molecular scaffold for the synthesis of pharmaceutical analogues with neuroprotective, primarily anticonvulsant, properties. Although both compounds have been chemically isolated and characterized for several decades, their biosynthetic pathway remained largely unknown until recently. In 2020, a putative biosynthetic pathway for the production of ibotenic acid and muscimol was proposed for the first time, based on seven genes (iboH, iboA, iboF, iboG1, iboG2, iboC, and iboD) that form a non-canonical biosynthetic gene cluster (BGC) in the genome of A. muscaria. However, to date, only the function of the first gene in the pathway (iboH) has been experimentally validated, while the roles of the remaining genes remain largely hypothetical. In the present thesis, the function of the proposed ibo biosynthetic gene cluster (BGC) was investigated through the reconstruction and heterologous expression of the pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The selection of S. cerevisiae as a model organism was based on its extensive genetic toolbox, ease of cultivation and genetic manipulation, as well as its widespread use as a microbial cell factory to produce natural products through metabolic engineering approaches. To this end, three expression cassettes carrying different combinations of ibo cluster genes (HDC, G1F, and G2A cassettes) were designed and constructed. The inducible GAL1 promoter was employed as a pathway “switch” to control the expression of the first gene of the cluster, i.e., the iboH gene, while strong constitutive promoters were used for the expression of the remaining ibo genes. The cassettes were subsequently integrated into the S. cerevisiae genome through targeted replacement of the UGA4, PUT4, and GAP1 loci using the CRISPR-Cas9 system. Expression of the ibo genes was confirmed by RT-qPCR analysis six hours post-galactose induction. To investigate metabolite production, extracts from the final engineered yeast strain were analyzed at 6, 12, and 24 hours post-galactose induction using Liquid Chromatography- Mass Spectrometry (LC-MS). The results did not demonstrate the production of either ibotenic acid or muscimol. Therefore, the identification and characterization of potential pathway intermediates constitute the next step toward determining the metabolic bottleneck responsible for the interruption of pathway flux. Furthermore, recent whole genome sequencing data obtained from the Amanita muscaria ATHUM10505 strain, which served as the source strain of the cloned ibo genes, revealed that the sequence of the cloned iboC gene corresponds to an extra-cluster likely paralogous gene exhibiting approximately 80% sequence similarity to the iboC gene located within the ibo BGC. This finding may provide a possible explanation for the failure to detect the final pathway products."],"dc:identifier":["uoadl:5425793","https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/5425793"],"dc:language":["Ελληνικά","Greek"],"dc:subject":["Θετικές Επιστήμες","Science"],"dc:title":["Μελέτη του βασιδιομύκητα Amanita muscaria για την έκφραση γονιδίων και παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών για φαρμακολογική αξιοποίηση"],"dc:type":["born_digital_postgraduate_thesis","Διπλωματική Εργασία","Postgraduate Thesis"]},"updated_at":"2026-08-21T16:41:59Z"}