Investigations into the mode of action of the DNA uridine endonuclease Mth212 of Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH

Die spontane hydrolytische Desaminierung von Cytosin zu Uracil ist eine der häufigsten DNA-Modifikationen während des zellulären Stoffwechsels. Um dieser mutagenen Wirkung zu widerstehen, entfernen die meisten Organismen Uracil-Reste aus der DNA mittels Basen-Exzisionsreparatur (BER). Diese wird von einer spezifischen Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) eingeleitet. UDGasen sind hoch konservierte und weit verbreitete DNA-Reparaturenzyme, die in fast allen lebenden Organismen vorhanden sind. Auffällig ist allerdings das Fehlen jeglicher Gene der UDG-Familie in Methanothermobacter thermautotrophicus, einem thermophilen Archaeon. Mth212 von M. thermautotrophicus ist das einzige Homolog der ExoIII-Familie, das neben allen ExoIII-Aktivitäten, eine Uridin-Endonuklease-Aktivität besitzt. Mth212 erkennt Uracil in dsDNA und spaltet die Phosphodiesterbindung auf der 5"-Seite des 2 dU-Restes, wobei ein Einzelstrangbruch entsteht. Das Ziel dieses Projekts war es, einen Einblick in den Mechanismus der spezifischen Substraterkennung durch Mth212 sowie die strukturellen Eigenschaften, die diese Erkennung ermöglichen, zu gewinnen. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein konservierter Abspartat-Rest (Asp-151) in Mth212 durch Asparagin (D151→N) ersetzt. Die Mth212/D151N Mutante wurde bezüglich enzymatischer Aktivität und Substratbindung analysiert. Die D151→N Substitution schaltet sowohl die AP- als auch die U-Endonukleaseaktivität aus, hat aber keinen Einfluss auf die Fähigkeit des Enzyms zur Substratbindung. Diese Daten zeigen, dass Mth212 ein einzelnes katalytisch aktives Zentrum für beide genannten Endonukleaseaktivitäten besitzt. Die Beibehaltung der Substrat-bindenden Eigenschaften deutet auf korrekte Faltung der Mth212/D151N-Mutante hin. Die Analyse der Affinität von Mth212/D151N zu verschiedenen dsDNA-Substraten mit einer AP-Stelle oder U/X-Basenopposition (X: Py oder Pu) ergab folgende Abnahme der Bindungsstärken: AP-Stelle>DNA-Enden [mit 5 Überhang oder blunt]>U/Py>U/Pu. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Mth212 in vitro ein DNA-Substrat entweder in Endo- oder Exo-Modus binden kann. Es ist sehr wahrscheinlich, dass der Modus der Substratbindung sowohl die Stärke der Substratbindung als auch die Wirksamkeit der Gesamtreaktion bestimmt. Mth212 spaltet verschiedene U/X-Basenoppositionen mit unterschiedlichen Präferenzen. Die U/Py-Basenoppositionen werden schneller gespalten als solche mit Purinen. Somit korreliert die Substratspaltungsrate mit den Substratbindungsstärken. Diese Besonderheit der enzymatischen Aktivität kann auf die unterschiedlichen Basenpaarungseigenschaften der verschiedenen U/X-Basenoppositionen zurückzuführen sein, da diese die energetischen Kosten für das Flipping-out des Uracilrestes aus dem DNA-Basenstapel beeinflussen. Darüber hinaus spricht der beobachtete Unterschied in der Substratspaltung dafür, dass das Flipping-out der Base der geschwindigkeitslimitierende Faktor der Gesamtreaktion von Mth212 ist. Auf Grundlage der Ergebnisse der Bindungsstudien und der Untersuchung der Substratspaltung wurde ein Nucleotide-flipping-Mechanismus für die Erkennung und Prozessierung des Uracils vorgeschlagen. Bei der kristallographischen Analyse von Mth212/D151N im Komplex mit spezifischen DNA-Substraten lag in allen Protein-DNA Komplexen ein exo-Bindungsmodus vor, wobei eines der 3"-Enden der DNA-Substrate im aktiven Zentrum fixiert war. Da freie DNA-Enden in vivo selten auftreten, ist es sehr wahrscheinlich, dass Mth212 ähnlich wie andere schadenspezifische DNA-Reparatur-Enzyme an einer zufälligen Position an die DNA bindet und dann an ihr entlanggleitet, bis das Enzym auf eine Läsion trifft, diese spezifisch bindet und repariert.

Author dc:creator

• Ciirdaeva, Elena

Contributors dc:contributor

• Fritz, Hans-Joachim Prof. Dr.
• Kramer, Wilfried PD Dr.
• Ficner, Ralf Prof. Dr.
• Irniger, Stefan PD Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Cytosin-Desaminerung
• thermophiles Archaeon
• Uridin-Endonuklease
• Uridin-Reparatur
• cytosine deamination
• thermophilic archaeon
• uridin endonuclease
• uridine repair
• 4213
• WJL 100: DNA, RNA, Replikation {Biologie, Genetik}

Licence

• https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-347
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2403-2
webdoc-2403
642414637

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AD99-3