Structural and biochemical characterization of diheme <i>c</i>-type cytochromes

Cytochrome sind eine weit verbreitete Proteinfamilie die Häm als prosthetische Gruppe beinhalten und in Vorgängen der Elektronenleitung oder Redoxreaktionen involviert sind. Das Hämmolekül besteht aus einem aromatischen Porphyrinring und einem zentral gebundenem Eisenatom. Cytochrome des c-Typs zeichnen sich durch die kovalente Bindung des Häms an das Proteinrückgrat aus. Ein auf Aminosäurebene konserviertes c-Typ Cytochrom Proteinbindemotiv stellt mit zwei Cysteinen, Sulfhydrylgruppen zur Verfügung, an die das Häm mittels zweier Thioetherbindungen angeheftet werden kann. Diese kovalente Bindung an das Protein ermöglicht den c-Typ Cytochromen einzigartige Eigenschaften, z.B. eine enge Anordnung von einer Vielzahl an Hämgruppen innerhalb des Proteins. Röntgenkristallographische Strukturaufklärung enthüllte das Vorhandensein zwei verschiedener Hämgruppenanordnungen. Ein paralleles und ein senkrechtes Packungsmotiv sind strukturell konserviert. Untersuchungen dieser Packungsmotive werden durch eine große Anzahl von Hämgruppen in Multihämcytochromen erschwert, da sich biochemische und spektroskopische Charakteristika mehrerer Hämgruppen aufsummieren und nicht unterscheidbar sind.Das rekombinante c-Typ Dihämcytochrom DHC2 aus dem anaeroben Mikroorganismus Geobacter sulfurreducens wurde in dem Bakterium Escherichia coli überexprimiert und mittels Affinitätschromatographie bzw. Gelfiltrationschromatographie bis zur Homogenität aufgereinigt. Das Protein wurde mittels UV/Vis-Spektralphotometrie, Elektronenspinresonanzspektroskopie und einer Redoxtitration charakterisiert. DHC2 wurde kristallisiert und mittels eines röntgenkristallograpischen Beugungsexperiments strukturell charakterisiert.Die Struktur zeigt das Vorhandensein von zwei Monomeren in der asymmetrischen Einheit, sowie zwei kovalent gebundene Hämgruppen in jedem Monomer, die in einem konservierten parallelen Packungsmotiv angeordnet sind. Die strukturelle Anordnung von Aminosäuren an den Hämgruppen spiegeln die Beobachtungen aus der Elektronenspinresonanzspektroskopie wieder, da die Imidazolringebenen der Histidinliganden einen kleinen dihedralen Winkel zueinander aufweisen. Die beobachteten Mittelpunktspotentiale von -135 mV und -289 mV werden durch die spezifische Geometrie der Hämgruppen und ihrer Liganden erreicht. Während der Strukturverfeinerung von DHC2 wurden ungewöhnlich hohe R-Faktoren für den Grad der Verfeinerung festgestellt, dies deutete auf ein Problem innerhalb der DHC2 Kristalle hin. Daher wurde eine intensive Analyse der kristallographischen Daten durchgeführt. Das Ergebnis dieser Untersuchung zeigte, dass die Kristalle von DHC2 pseudo-merohedral verzwillingt sind. Der Kristall besteht aus zwei Zwillingsdomänen in einem Verhältnis von 2:1 mit dem Verzwillingungsgesetz l, -k, h. Die pseudo-merohedrale Verzwillingung wird durch eine pseudo-orthorhombische nicht-kristallographische Symmetrie ermöglicht. Der Kristall besteht der Ordnungs- und Disordnungstheorie (OD) zufolge aus Schichten, die durch Translation den Kristall aufbauen. Schwache Bindungen der einzelnen Proteinmoleküle führen zu einer uneindeutigen Translation dieser Schichten. Die Verzwillingung ist somit ein Resultat der Proteinkontakte innerhalb des Kristalls.Eine Mutationsstudie an DHC2 wurde mit dem Zweck durchgeführt diese Verzwillingung zu beseitigen. Eine strukturell charakterisierte Mutante zeigt dabei ein verbessertes Streuvermögen, eine höhere Symmetrie der Kristallstruktur und eine Beseitigung des Verzwillungsphänomens. Die strukturelle Anordnung des Proteins unterscheidet sich nur im Bereich der Mutation vom Wildtyp. Das Vorhandensein nicht-kristallographischer Translationssymetrie, repräsentiert den einzigen Nachteil dieser Mutante, da sie sich negativ auf die Intensitäten der gemessenen Beugungsreflexe auswirkt.

Author dc:creator

• Heitmann, Daniel

Contributors dc:contributor

• Einsle, Oliver Prof. Dr.
• Ficner, Ralf Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Röntgenkristallographie
• <i>c</i>-Typ Cytochrom
• OD-Theorie
• Verzwillingung
• Pseudosymmetrie
• X-ray crystallography
• <i>c</i>-type cytochrome
• OD-theory
• twinning
• pseudo-symmetry
• 35.25
• 35.70
• SXC 000: Struktur von Biomolekülen {Biochemie}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-299
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1969-0
webdoc-1969
59607610X

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AD1C-0