Identifizierung und Charakterisierung von Genen und korrespondierenden Genprodukten aus Metagenombanken, die Butanol-Dehydrogenase-Aktivität oder proteolytische Aktivität vermitteln

In den vergangenen Jahren wurde es durch kultivierungsunabhängige metagenomische Analysen ermöglicht, die natürlich vorkommende mikrobielle Diversität als nahezu unerschöpfliche Ressource für neuartige Biokatalysatoren und Wirkstoffe zu erschließen. Dazu wird die gesamte mikrobielle DNA aus einer Standortprobe isoliert und direkt kloniert. Die Hinterlegung der auf diesem Weg erhaltenen genetischen Informationen erfolgt in komplexen Genbanken, so genannten Metagenombanken. Diese können in heterologen Wirten beliebig oft vermehrt, mit sequenzabhängigen oder auf biologischer Aktivität basierenden Verfahren analysiert und sowohl für die Anwendung als auch für die Forschung genutzt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Metagenombanken konstruiert und aktivitätsbasierend auf Gene durchmustert, die Butanol-Dehydrogenase-Aktivität oder proteolytische Aktivität vermitteln. Die für die entsprechenden Aktivitäten verantwortlichen Gene wurden anschließend identifiziert und charakterisiert.Im Rahmen des Butanol-Dehydrogenase-Screenings konnten zwei positive Escherichia coli-Klone identifiziert werden, deren rekombinanten Plasmide (pTWB3 bzw. pTWB4) in der Lage waren, eine stabile NADPH-abhägige Butanol-Dehydrogenase-Aktivität zu vermitteln. Durch weitere Untersuchungen konnte bei pTWB4 das für die Aktivität verantwortliche Gen identifiziert werden. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Genprodukts zeigte keinerlei Ähnlichkeiten zu Proteinsequenzen von bekannten Alkohol-Dehydrogenasen oder Oxidoreduktasen, sondern wies große Übereinstimmungen zu der Proteinsequenz einer Oligoendopeptidase aus Bacillus licheniformis auf.Im Rahmen des Screenings nach proteolytischer Aktivität konnten fünf positive E. coli Klone identifiziert werden, von denen zwei näher charakterisiert wurden. Auf den Insertsequenzen der aus diesen Stämmen isolierten rekombinanten Plasmide, konnte jeweils ein Protease-Gen (mprA und mprB) identifiziert werden. Die Aminosäuresequenzen der beiden abgeleiteten Genprodukte zeigten Ähnlichkeiten zu einer Zink-abhängigen Metalloprotease aus Pseudoalteromonas sp. str. A28. Durch weitere Sequenzanalysen konnten MprA und MprB in die Familie M4 der Zink-abhängigen Metalloproteasen eingestuft werden. Proteasen dieser Familie zeichnen sich dadurch aus, dass es sich um sekretierte Enzyme handelt, welche als inaktive Vorläufer Proteine gebildet werden. Sie besitzen N-terminale und teilweise auch C-terminale Prosequenzen, denen unterschiedliche Funktionen bei der Reifung der Proteasen zugesprochen wird. Die Gene mprA und mprB sowie unterschiedliche Derivate mit Deletionen im N-terminalen bzw. C-terminalen Genbereichen wurden in E. coli BL21-Zellen produziert. Es konnte gezeigt werden, dass der N-terminale Genbereich im Gegensatz zum C-terminalen Genbereich essentiell für die proteolytische Aktivität der Proteasen ist. Ferner zeigten nur in den Kulturüberstand exportierte Enzyme Aktivität. Weiterhin erfolgte eine biochemische Charakterisierung der aktiven Proteasen und ihrer aktiven Derivate.

Author dc:creator

• Waschkowitz, Tanja

Contributors dc:contributor

• Daniel, Rolf PD Dr.
• Liebl, Wolfgang Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
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• Metagenomik
• Umweltgenbanken
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• Butanol-Dehydrogenasen
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• 42.30 Mikrobiologie
• WUV 000 Angewandte Mikrobiologie
• WUK 000 Genetik der Mikroorganismen
• Molekularbiologie der Mikrorganismen

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-645
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-760-6
webdoc-760
515127035

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AC66-E