Molecular mechanisms governing germ line development in zebrafish and the role of this lineage in sexual differentiation

Während der Embryonalentwicklung des Zebrafisch (Danio rerio) werden die Urkeimzellen sehr früh von den anderen Zelllinien durch eine maternale, spezifische Form des Cytoplasmas, dem so genannten Keimplasma, unterschieden. Bei den nachfolgenden Zellteilungen verteilt sich dieses Keimplasma asymmetrisch, so dass es jeweils nur in die späteren Keimzellen und nicht in die späteren somatischen Zellen gelangt. Das Keimplasma enthält Schlüsselfaktoren, die das Entwicklungspotential seiner Zellen auf das der Keimzellen festlegen. So ist z.B. die RNS verschiedener Keimzell-spezifischer Gene, wie vasa, nanos1 und dead end (dnd), im Keimplasma angereichert und wird in der Keimbahn expremiert.Das erste Kapitel dieser Arbeit untersucht die zelluläre Lokalisation der Proteine Dead End und Nanos1 während verschiedener Entwicklungsstadien im Zebrafisch. Zu diesem Zweck entwickelten wir polyklonale Antikörper, die diese beiden Proteine detektieren. Dead End und Nanos1 kolokalisieren in den perinukleären Granula, welches Keimzell-spezifische Organellen mit noch unbekannter Funktion sind. In diesen perinukleären Granula sind Proteine angereichert, die von Keimplasma-spezifischen Genen kodiert werden. Eine genauere Charakterisierung dieser Organellen zeigte, dass sie in unmittelbarer Nähe zu den Zellkernporen lokalisiert sind. Wir stellen daher die Hypothese auf, dass Komponenten der perinukleären Granula an der posttranskriptionalen Regulation der Genexpression, wie z.B. mRNS- Stabilisierung, - Transport und/oder - Abbau, beteiligt sein könnten. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnten wir zeigen, dass loss-of-function Punktmutationen in dead end dazu führen, dass das Dead End Protein nicht mehr in den perinukleären Granula sondern im Zellkern lokalisiert ist.Das zweite Kapitel dieser Arbeit behandelt die Rolle von dead end in der Geschlechtsdeterminierung. Embryonen, in die ein Morpholino injiziert wurde, der die Translation von dead end blockiert, besitzen keine Keimzellen. Darüber hinaus entwickeln sich diese Embryonen ausschließlich zu sterilen Männchen. Dies lässt vermuten, dass für die Geschlechtsdeterminierung im Zebrafisch entweder funktionales Dead End Protein oder das Vorhandensein von Keimzellen essentiell ist. Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde eine alternative Methode zur Entfernung von Keimzellen angewandt. Diese Methode basiert auf dem bicistronischen Toxin-Antidote-System, welches die Expression eines Giftes (Toxin) in den Keimzellen ermöglicht während die somatischen Zellen durch ein Gegengift (Antidote) geschützt sind. Keimzelllose Embryonen, die durch diese dead end unabhängige Methode erzeugt wurden, entwickelten sich ebenfalls überwiegend zu Männchen. Dies zeigt, dass die Existenz von Keimzellen wichtig für die Geschlechtsdeterminierung im Zebrafisch ist.Das letzte Kapitel dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von RNS-Interferenz während der Keimzellentwicklung im Zebrafisch. RNS-Interferenz ist ein in vielen Organismen verbreiteter Mechanismus zum Ausschalten von Genen. Über die Existenz von RNS-Interferenz im Zebrafisch gibt es jedoch nur wenige und widersprüchliche Daten. Da das Ausschalten von Genen während der Keimzellentwicklung in verschiedenen Organismen sehr häufig beobachtet wird, untersuchten wir, ob die Funktion von small interfering RNAs (siRNAs) und micro RNAs (miRNAs) wichtig für die Spezifizierung und Entwicklung von Keimzellen im Zebrafisch ist.Unsere Ergebnisse zeigen, dass beiden Prozesse, die Hemmung von Translation durch miRNA und der siRNA vermittelter Abbau von mRNS, ein unterschiedliches Potential zur Ausschaltung von Genen besitzen. Die Anwendung von siRNAs führte gelegentlich zu einem Abbau von mRNS, wobei die Effizienz des Abbaus von Gen zu Gen variierte. Die miRNA Oligonukleotide könnten benutzt werden, um spezifische Gensequenzen an genau definierten Positionen auszuschalten. Die genauen Anforderungen an diese Zielsequenzen können jedoch bislang noch nicht genau definiert werden. Dieses beschränkte Wissen bezüglich der erfolgreichen Voraussage von miRNA-Bindungsstellen erschwert den Gebrauch dieser Technik im Zebrafisch. Dies gilt vor allem im Vergleich zu gut etablierten Techniken wie Morpholino-antisense-Oligonukleotiden, die zur Hemmung der Translation von mRNS eingesetzt werden. Da wir die Existenz von RNS-Interferenz zur Regulation von endogenen Genen nicht nachweisen konnten, weder in somatischen noch in Keimzellen, bleibt die Frage offen, ob RNS-Interferenz die Genregulation in einer dieser beiden Zellpopulationen regelt.

Author dc:creator

• Slanchev, Krasimir Ivanov

Contributors dc:contributor

• Raz, Erez Prof. Dr.
• Wimmer, Ernst A. Prof. Dr.
• Feussner, Ivo Prof. Dr.
• Gradmann, Dietrich Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Zebrafisch
• <i>Danio rerio</i>
• Keimzellen
• Keimplasma
• dead end
• zebrafish
• germ cells
• germ plasm
• 42
• WK 000: Entwicklungsbiologie

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-626
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-681-7
webdoc-681
512657033

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-ABB4-6