The establishment and characterization of an improved cell-free assay for exocytosis in neuroendocrine PC12 cells

Die regulierte Exozytose wird in Neuronen und neuroendokrinen Zellen durch die SNARE-Proteine Synaptobrevin/VAMP, SNAP-25 and Syntaxin1 vermittelt. Während der Fusion bilden diese SNARE-Proteine einen stabilen Komplex, der anschließend in einer konzertierten Aktion von α-SNAP und der AAA-ATPase NSF dissoziiert wird. In dieser Arbeit wurde ein zellfreier Exozytose-Assay entwickelt.Auf beschichteten Objektträgern wachsende PC12-Zellen wurden durch einen Ultraschallpuls in einer kleinen Kammer direkt auf dem Objekttisch eines Fluoreszenzmikroskops aufgeschlossen. Durch Ca2+ konnten eGFP-beladenen Vesikel der so hergestellten "membrane lawns" zur Exozytose und damit zur Ausschüttung ihres Inhalts gebracht werden. Durch den entwickelten Assay konnte die Zeitspanne zwischen dem Zellaufschluß und der vorgenommen Exozytose-Messung verringert und damit der biochemische "run-down" der Membranen reduziert werden.Durch diese Methode konnte eine Vielzahl verschiedener Faktoren auf frisch hergestellte in Ihren Eigenschaften intakten Membranen stark ähnelnden "membrane lawns" getestet und dadurch die späten Schritte der Exozytose für Untersuchungen zugänglich gemacht werden. Die Cytosol- und ATP-Mg-Abhängigkeit dieses Assays wurde addresiert. Übereinstimmend mit vorhergehenden Beobachtungen an permeabilisierten Zellen ist ATP-Mg von entscheidender Wichtigkeit für die Fähigkeit des Systems, auf eine Erhöhung der Ca2+-Konzentration zu reagieren. Im Gegensatz zur Ausschüttung von Noradrenalin in permeablisierten PC12-Zellen allerdings, ist das in dieser Arbeit beschriebene System nicht abhängig von Cytosol.In der folgenden Studie konnte mit dem beschriebenen zellfreien Assay gezeigt werden, dass die Ca2+-abhängige Exzytose von bereits "gedockten" sekretorischen Granulen unabhängig von NSF stattfindet, jedoch durch die Zugabe von rekombinatem α-SNAP stark inhibiert wird. Desweiteren wurde festgestellt, dass diese Inhibition mit der Bindung von α-SNAP an kleine mit Syntaxin 1 co-lokalierende "cluster" auf der cytosolischen Seite der Plasmamembran einhergeht. Durch Inkubation mit Botulinum Neurotoxin C1, einer Protease die spezifisch Syntaxin 1 schneidet, konnte diese Bindung unterbunden werden. Sowohl die Bindung an die Membran, als auch die Inhibition der Exozytose wurden durch die Gegenwart von NSF verhindert. Für eine Mutante von α-SNAP, die NSF nicht mehr aktiveren kann, war dies nicht der Fall. Wir können daher folgern, dass α-SNAP die Exozytose dadurch inhibiert, dass es die Interaktion von Syntaxin mit seinen SNARE-Partner verhindert, ein Befund, der eine unerwartet Role von α-SNAP in der Exozytose enthüllt.

Author dc:creator

• Barszczewski, Marcin Miroslaw

Contributors dc:contributor

• Jahn, Reinhard Prof. Dr.
• Neher, Erwin Prof. Dr.
• Brose, Nils Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• SNARE
• NSF
• alpha-SNAP
• PC12-Zellen
• ATP
• Exozytose
• priming
• Fusion
• PC12 cells
• exocytosis
• 42.13
• 42.15
• WHC 100: Zellmembranen, Zelloberfläche, Zellwand, intrazelluläre Membranen {Cytologie}
• WHF 800: Permeabilität, inter- und intrazellulärer Transport {Cytologie}

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html

Language dc:language

eng

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-603
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-584-8
webdoc-584
515233455

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AB9C-D