Konstruktion eines bakteriellen Systems zum Export von Coenzym B₁₂

Coenzym B12 wird in der Natur ausschließlich im Cytoplasma von einigen Bakterien und Archaeen gebildet. An der B12-Synthese sind mehr als 30 verschiedene Enzyme beteiligt. Ein Exportsystem für B12 ist unbekannt. Ziel der Arbeit war es, ein solches Exportsystem zu entwickeln. Hierzu sollte B12 gebunden an ein B12-Bindeprotein aus der Bakterienzelle über die Cytoplasmamembran transportiert werden. Die Proteintranslokation erfolgte über den Signalsequenz-abhängigen Tat ( twin arginine translocation")-Transportweg, der native Enzyme mit gebundenem Kofaktor wie z. B. die Trimethylamin-N-Oxid-Reduktase (TorA) aus Escherichia coli exportiert. Für die Konstruktion des B12-Exporters wurde die Tat-Signalsequenz von TorA mit dem menschlichen B12-bindenden Intrinsic Faktor (IF) bzw. der B12-bindenden Untereinheit (MutB) der Methylmalonyl-CoA-Mutase aus E. coli fusioniert. Zur Detektion der gebildeten Fusionsproteine wurden an das 3`-Ende der Gene die Sequenz für einen His6- oder Strep-Tag angefügt. Western-Blot-Analysen zeigten nur eine geringe Produktion des sigTorA-IF-Fusionsproteins, dagegen wurde das sigTorA-MutB Fusionsprotein in großen Mengen in verschiedenen Enterobakterien wie z.B. Citrobacter freundii und Escherichia blattae produziert. Weiterführende Experimente zur zellulären Lokalisation des sigTorA-MutB Fusionsproteins belegten, das eine Kotranslokation und somit ein Export von B12 und MutB ins Periplasma der Zellen erfolgte. Quantitative Bestimmungen des Corrinoidgehaltes bei C. freundii und E. blattae zeigten außerdem, dass die heterologe Bildung von sigTorA-MutB zu einer bis zu 57% gesteigerten B12-Produktionsrate führte.

Author dc:creator

• Toeche-Mittler, Caroline

Contributors dc:contributor

• Gottschalk, Gerhard Prof. Dr.
• Liebl, Wolfgang Prof. Dr.

• 570 Biowissenschaften, Biologie
• Biologie
• Coenzym B<SUB>12</sub>
• bakterielles Exportsystem
• Tat-Transportweg
• TorA
• Intrinsic Faktor
• Methylmalonyl-CoA-Mutase
• coenzyme B<SUB>12</sub>
• bacterial export system
• Tat pathway
• intrinsic factor
• methylmalonyl-CoA mutase
• 42.3
• WUE200

Licence

• https://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htm

Language dc:language

ger

Identifier

https://dx.doi.org/10.53846/goediss-598
urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-561-1
webdoc-561
379358778

OAI identifier oai:identifier

oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0006-AB97-8