ESTABLISHING DRIED MATRIX SPOT PROTEOMICS FOR DISCOVERY IN VARIOUS BIOLOGICAL MATRICES

Η πρωτεομική αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους και ταχύτερα αναπτυσσόμενους τομείς της σύγχρονης βιοϊατρικής έρευνας, καθώς επιτρέπει τη συστηματική μελέτη του συνόλου των πρωτεϊνών που εκφράζονται σε ένα κύτταρο, έναν ιστό ή έναν οργανισμό σε δεδομένες συνθήκες. Οι πρωτεΐνες αποτελούν τα βασικά λειτουργικά μόρια των κυττάρων και συμμετέχουν σε πληθώρα κυτταρικών διεργασιών, όπως η μεταγωγή σημάτων, ο μεταβολισμός, η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και η απόκριση σε περιβαλλοντικά ή παθολογικά ερεθίσματα. Η κατανόηση των πρωτεϊνικών προφίλ σε διαφορετικά βιολογικά συστήματα μπορεί να συμβάλλει ουσιαστικά στην αποκάλυψη μοριακών μηχανισμών ασθενειών, στην ανακάλυψη νέων βιοδεικτών και στην ανάπτυξη στοχευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Τα τελευταία χρόνια, η πρόοδος στη φασματομετρία μάζας υψηλής ευκρίνειας και στην ανάπτυξη προηγμένων υπολογιστικών εργαλείων έχει επιτρέψει την ταυτόχρονη ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση χιλιάδων πρωτεϊνών από πολύπλοκα βιολογικά δείγματα. Ωστόσο, παρά τη σημαντική εξέλιξη των αναλυτικών τεχνολογιών, η επιτυχία μιας πρωτεομικής ανάλυσης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ποιότητα και τη σταθερότητα των βιολογικών δειγμάτων που χρησιμοποιούνται. Η σωστή συλλογή, αποθήκευση και μεταφορά των δειγμάτων αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για τη διατήρηση της πρωτεϊνικής πληροφορίας και για την εξασφάλιση αξιόπιστων και αναπαραγώγιμων αποτελεσμάτων. Στις περισσότερες πρωτεομικές μελέτες, τα βιολογικά δείγματα αποθηκεύονται σε υγρή μορφή και διατηρούνται σε χαμηλές θερμοκρασίες, συνήθως στους −80°C. Η μεταφορά τους μεταξύ εργαστηρίων πραγματοποιείται συχνά με χρήση ξηρού πάγου, ώστε να διατηρείται η ψυχρή αλυσίδα και να αποφεύγεται η αποικοδόμηση των πρωτεϊνών. Παρότι η προσέγγιση αυτή είναι αποτελεσματική, παρουσιάζει αρκετούς πρακτικούς περιορισμούς. Η ανάγκη για συνεχή ψύξη αυξάνει σημαντικά το κόστος μεταφοράς και αποθήκευσης, ενώ δημιουργεί και τεχνικές δυσκολίες, ιδιαίτερα σε διεθνείς συνεργασίες ή σε περιβάλλοντα όπου η πρόσβαση σε εξειδικευμένες υποδομές είναι περιορισμένη. Επιπλέον, ακόμη και μικρές διακυμάνσεις της θερμοκρασίας μπορεί να οδηγήσουν σε υποβάθμιση του δείγματος και σε αλλοίωση του πρωτεϊνικού προφίλ. Για τον λόγο αυτό, τα τελευταία χρόνια υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για εναλλακτικές μεθόδους διατήρησης βιολογικών δειγμάτων που να επιτρέπουν την αποθήκευση και μεταφορά τους σε θερμοκρασία δωματίου χωρίς σημαντική απώλεια της πρωτεϊνικής πληροφορίας. Μία από τις πιο υποσχόμενες προσεγγίσεις είναι η τεχνική των αποξηραμένων δειγμάτων σε στερεή μήτρα, γνωστή ως Dried Matrix Spots (DMS). Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην εναπόθεση μικρής ποσότητας βιολογικού υλικού πάνω σε υποστρώματα κυτταρίνης, όπου το δείγμα αφήνεται να αποξηρανθεί πλήρως. Κατά τη διαδικασία της ξήρανσης μειώνεται σημαντικά η ενζυμική δραστηριότητα και επιβραδύνονται οι αντιδράσεις αποικοδόμησης, γεγονός που οδηγεί στη σταθεροποίηση των πρωτεϊνών. Παρόμοιες προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς σε άλλους τομείς της Κλινικής Χημείας, όπως στην ανάλυση μεταβολιτών ή φαρμάκων μέσω των λεγόμενων Dried Blood Spots (DBS). Ωστόσο, η εφαρμογή της τεχνικής αυτής σε ανακαλυπτική πρωτεομική μεγάλης κλίμακας παραμένει περιορισμένη, και η καταλληλότητά της για τέτοιου είδους αναλύσεις δεν έχει διερευνηθεί πλήρως. Στο πλαίσιο αυτό, η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία είχε ως κύριο στόχο την αξιολόγηση της τεχνικής των Dried Matrix Spots ως εναλλακτικής μεθόδου προετοιμασίας και αποθήκευσης δειγμάτων για εφαρμογές ανακαλυπτικής πρωτεομικής. Συγκεκριμένα, εξετάστηκε κατά πόσο η αποξήρανση των δειγμάτων επηρεάζει τη δυνατότητα ταυτοποίησης και ποσοτικοποίησης πρωτεϊνών σε σύγκριση με τα συμβατικά υγρά δείγματα.Για την υλοποίηση της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν ιστοί ήπατος ποντικού, οι οποίοι επιλέχθηκαν ως μοντέλο βιολογικού συστήματος λόγω της υψηλής μεταβολικής δραστηριότητας και της πλούσιας πρωτεϊνικής σύστασής τους. Οι ιστοί υποβλήθηκαν σε διαδικασία ομογενοποίησης και εκχύλισης πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά λυτικά διαλύματα, ώστε να αξιολογηθεί η επίδραση των διαφορετικών συνθηκών εκχύλισης στα τελικά πρωτεομικά αποτελέσματα. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε το RIPA buffer, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο λυτικό διάλυμα που περιέχει ισχυρά απορρυπαντικά και επιτρέπει την αποτελεσματική εκχύλιση πρωτεϊνών από κυτταρικές και μεμβρανικές δομές, καθώς και ένα διάλυμα βασισμένο στο Igepal, το οποίο αποτελεί πιο ήπιο απορρυπαντικό σύστημα. Με τον τρόπο αυτό κατέστη δυνατή η σύγκριση της αποτελεσματικότητας των δύο πρωτοκόλλων εκχύλισης σε συνδυασμό με τη διαδικασία δημιουργίας των αποξηραμένων δειγμάτων.Τα εκχυλίσματα που προέκυψαν χωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες δειγμάτων. Στην πρώτη περίπτωση, τα δείγματα διατηρήθηκαν σε υγρή μορφή, αποτελώντας τα λεγόμενα wet lysates, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως σημείο αναφοράς για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων. Στη δεύτερη περίπτωση, μικρές ποσότητες των εκχυλισμάτων εναποτέθηκαν σε ειδικά υποστρώματα κυτταρίνης και αφέθηκαν να αποξηρανθούν πλήρως, δημιουργώντας τα Dried Matrix Spots. Η πειραματική μελέτη σχεδιάστηκε ώστε να εξεταστεί η επίδραση διαφορετικών συνθηκών αποθήκευσης στη σταθερότητα των αποξηραμένων δειγμάτων. Συγκεκριμένα, τα δείγματα φυλάχθηκαν είτε σε θερμοκρασία δωματίου είτε στους 4°C, ενώ αξιολογήθηκαν δύο χρονικά σημεία αποθήκευσης, στις δύο και στις τέσσερις εβδομάδες. Με τον τρόπο αυτό διερευνήθηκε κατά πόσο η διάρκεια και η θερμοκρασία αποθήκευσης επηρεάζουν τη διατήρηση της πρωτεϊνικής πληροφορίας. Μετά την ολοκλήρωση της περιόδου αποθήκευσης, τα αποξηραμένα δείγματα επανυδατώθηκαν και υποβλήθηκαν σε διαδικασία προετοιμασίας για πρωτεομική ανάλυση. Η διαδικασία αυτή περιλάμβανε στάδια αναγωγής και αλκυλίωσης των πρωτεϊνών, προκειμένου να διασπαστούν οι δισουλφιδικοί δεσμοί και να σταθεροποιηθεί η τριτοταγής δομή των πρωτεϊνών. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ενζυμική πέψη με θρυψίνη, κατά την οποία οι πρωτεΐνες διασπώνται σε μικρότερα πεπτίδια κατάλληλα για ανάλυση με φασματομετρία μάζας.Τα παραγόμενα πεπτίδια καθαρίστηκαν με χρήση StageTip purification, βασισμένη σε υλικά C18 αντίστροφης φάσης, διαδικασία που επιτρέπει την απομάκρυνση αλάτων και άλλων παρεμβαλλόμενων ουσιών που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την απόδοση της φασματομετρικής ανάλυσης. Η ανάλυση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με χρήση συστήματος nanoLC–MS/MS, σε συνδυασμό με την τεχνική DIA-PASEF (Data Independent Acquisition – Parallel Accumulation Serial Fragmentation). Η τεχνολογία αυτή επιτρέπει υψηλής ευαισθησίας και μεγάλης κάλυψης πρωτεομικές αναλύσεις, ενώ παράλληλα προσφέρει υψηλή αναπαραγωγιμότητα μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων. Τα δεδομένα που προέκυψαν από τη φασματομετρία μάζας αναλύθηκαν με τη βοήθεια σύγχρονων βιοπληροφορικών εργαλείων, όπως τα λογισμικά FragPipe και DIA-NN, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών σε δεδομένα DIA. Η στατιστική ανάλυση και η οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκαν στο υπολογιστικό περιβάλλον R, επιτρέποντας τη σύγκριση των διαφορετικών συνθηκών αποθήκευσης και τύπων δειγμάτων. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι η τεχνική των Dried Matrix Spots μπορεί να διατηρήσει σε μεγάλο βαθμό το πρωτεϊνικό περιεχόμενο των δειγμάτων ακόμη και μετά από αρκετές εβδομάδες αποθήκευσης. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε πολύ υψηλό ποσοστό επικάλυψης μεταξύ των πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν στα αποξηραμένα δείγματα και εκείνων που ανιχνεύθηκαν στα αντίστοιχα υγρά δείγματα αναφοράς. Η πλειονότητα των πρωτεϊνών που ανιχνεύθηκαν στα wet lysates εντοπίστηκε επίσης στα DMS δείγματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η διαδικασία ξήρανσης δεν οδηγεί σε σημαντική απώλεια πρωτεϊνικής πληροφορίας. Παράλληλα, η ποσοτική σύγκριση των δεδομένων έδειξε ισχυρή συσχέτιση στην αφθονία των πρωτεϊνών μεταξύ των διαφορετικών μορφών δειγμάτων. Οι διακυμάνσεις που παρατηρήθηκαν ήταν περιορισμένες και συγκρίσιμες με εκείνες που εμφανίζονται συνήθως μεταξύ τεχνικών επαναλήψεων σε πρωτεομικές αναλύσεις. Επιπλέον, η θερμοκρασία αποθήκευσης δεν φάνηκε να επηρεάζει σημαντικά τα αποτελέσματα της πρωτεομικής ανάλυσης. Τα δείγματα που διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου παρουσίασαν πρωτεομικά προφίλ παρόμοια με εκείνα που αποθηκεύτηκαν στους 4°C ακόμη και μετά από τέσσερις εβδομάδες. Το εύρημα αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό, καθώς υποδεικνύει ότι τα αποξηραμένα δείγματα μπορούν να μεταφέρονται και να αποθηκεύονται χωρίς την ανάγκη ψυχρής αλυσίδας. Η σύγκριση μεταξύ των δύο λυτικών διαλυμάτων έδειξε ότι οι διαφορές που παρατηρήθηκαν σχετίζονται κυρίως με τη διαφορετική ικανότητα εκχύλισης πρωτεϊνών από τους ιστούς και όχι με τη διαδικασία αποξήρανσης των δειγμάτων. Το RIPA buffer παρουσίασε υψηλότερη απόδοση στην εκχύλιση μεμβρανικών πρωτεϊνών, ενώ το Igepal buffer παρείχε ελαφρώς διαφορετικά πρωτεϊνικά προφίλ, όπως ήταν αναμενόμενο λόγω της διαφορετικής σύστασής του. Συνολικά, μόνο ένα μικρό ποσοστό πρωτεϊνών εμφάνισε στατιστικά σημαντικές μεταβολές στην αφθονία του μεταξύ των διαφορετικών συνθηκών αποθήκευσης, χωρίς να παρατηρείται κάποιο σαφές μοτίβο που να υποδηλώνει εκτεταμένη αποικοδόμηση των πρωτεϊνών. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν τη σταθερότητα των αποξηραμένων δειγμάτων και τη συμβατότητά τους με σύγχρονες πλατφόρμες πρωτεομικής ανάλυσης. Συμπερασματικά, η παρούσα εργασία δείχνει ότι η τεχνική των Dried Matrix Spots αποτελεί μια αξιόπιστη και πρακτική προσέγγιση για τη διατήρηση και ανάλυση βιολογικών δειγμάτων σε πρωτεομικές μελέτες. Η δυνατότητα αποθήκευσης και μεταφοράς δειγμάτων σε θερμοκρασία δωματίου μπορεί να μειώσει σημαντικά το κόστος και τις τεχνικές δυσκολίες που σχετίζονται με την ψυχρή αλυσίδα, ενώ παράλληλα διευκολύνει τη συνεργασία μεταξύ διαφορετικών ερευνητικών ομάδων. Η περαιτέρω βελτιστοποίηση της μεθόδου και η εφαρμογή της σε διαφορετικούς τύπους βιολογικών δειγμάτων θα μπορούσε να συμβάλει στην ευρύτερη υιοθέτηση της τεχνικής αυτής στην πρωτεομική έρευνα. Μελλοντικές μελέτες θα μπορούσαν να διερευνήσουν τη χρήση των Dried Matrix Spots σε κλινικά δείγματα, καθώς και την αξιοποίησή τους σε πολυκεντρικές μελέτες μεγάλης κλίμακας.

Authors dc:creator

• ΤΖΑΝΑΪ ΑΝΤΖΕΛΑ
• TZANAI ANTZELA

• Θετικές Επιστήμες
• Science

Language dc:language

English

Identifier

uoadl:5372444

OAI identifier oai:identifier

oai:lib.uoa.gr:uoadl:5372444