NOVEL HETEROCYCLIC RING SYSTEMS DERIVED FROM CARACURINE V AS LIGANDS FOR THE ALLOSTERIC SITE OF MUSCARINIC M 2 RECEPTORS

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Gebiet allosterischer Modulation des muscarinischen M2 Rezeptors. Allosterische Liganden beeinflussen das Bindungsverhalten eines orthosterischen Liganden (Agonisten oder Antagonisten) an die klassische Bindungsstelle des muscarinischen Rezeptors, indem sie seine Affinität entweder erhöhen(positive Kooperativität) oder erniedrigen (negative Kooperativität). Die allosterische Bindungsstelle befindet sich extrazellulär am Eingang der Rezeptor-Bindungstasche. Sie ist weniger konserviert als die orthosterische Bindungsdomäne, die tiefer im Rezeptorkanal zwischen den sieben transmembranalen Domänen lokalisiert ist. Demzufolge ist die Entwicklung subtyp-spezifischer allosterisch wirkenden Liganden leichter als subtypspezifischer Agonisten oder Antagonisten. Die Subtypselektivität kann darüber hinaus über unterschiedliche Kooperativitäten zwischen dem orthosterischen und allosterischen Liganden an verschiedenen muscarinischen Subtypen erreicht werden. Ein am M1-Rezeptor mit Acetylcholin positiv kooperativer allosterer Modulator, der sich an anderen muscarinischen Subtypen neutral kooperativ verhält, könnte z.B. für die Therapie von Morbus Alzheimer eingesetzt werden. Bisquartäre Ammoniumsalze des Strychnos-Alkaloids Caracurin-V gehören zu den potentesten allosterischen M2-Liganden. Die relative Stellung der aromatischen Indolringe und der Abstand zwischen den positiv geladenen Stickstoffatomen (ca. 10) in dem sehr starren Caracurin-V-Ringsystem definieren den Pharmakophor für potente allosterische Modulatoren. Caracurin-V-Salze sind strukturell sehr verwandt mit den starken Muskelrelaxantien Toxiferin-I und Alcuronium und besitzen vermutlich selbst neuromuskulär-blockierende Eigenschaften, was ihre Anwendung in der pharmakologischen Forschung einschränken würde. Reduktion des Caracurin-V-Ringsystems auf die wesentlichen Pharmakophorelemente könnte zu allosterisch wirksamen Verbindungen mit vernachlässigbarer muskelrelaxierender Wirkung führen. Ziel dieser Arbeit war die Synthese und pharmakologische Testung von Derivaten eines neuen, von Caracurin V abgeleiteten, heterocyclischen Ringsystems. Das neue gewünscht 6,7,14,15-Tetrahydro[1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]-diindole-Ringsystem(6) wurde in einer intermolekularen N-Alkylierung von zwei Molekülen Bromethylindol 5 aufgebaut. Die Ausgangsverbindung 5 konnte aus dem Indolylessigsäuremethylester 3 durch Reduktion der Estergruppe zum Alkohol und anschließende Substitution durch Brom dargestellt werden. Der bekannte Ester 3 wurde ausgehend von Tryptamin erhalten. Die dreistufige Synthese umfasste N-Dibenzylierung, Einführung der Malonestergruppe am C-2 von Indol und anschließende Demethoxycarbonylierung. Die Totalsynthese des neuen Pentacyclus ist im Schema 24 dargestellt. Die 3D-Struktur des neuen Ringgerüstes konnte mit Hilfe von NMR-Spektroskopie und semiempirischen Rechnungen (AM1) aufgeklärt werden. Verbindung 6 liegt in Lösung in einer verdrehten Wanne-Konformation mit unsymmetrisch angeordneten Seitenketten vor. Um den Einfluss der Seitenkettenlänge des neuen Ringsystems auf die allosterische Wirksamkeit zu untersuchen, war es geplannt, die Ethylamin-Gruppen durch Methylamin-Einheiten zu ersetzen. Der entsprechende Syntheseplan bestand darin, das unsubstituierte Ringsystem in einer doppelten Mannich-Reaktion zu aminomethylieren. Der Ausgangsstoff für die Dimerisierung, Bromethylindol 32, wurde aus Indol-2-carbonsäure hergestellt. Die Synthese umfasste folgende Reaktionsschritte: Reduktion der Carboxylgruppe und Benzoylierung des resultierenden Alkohols, nucleophile Substitution mit Kaliumcyanid, alkalische Hydrolyse des Cyanids zu Indolacetessigsäure, erneute Reduktion zum Alkohol und abschließende Substitution mit Brom. Da Dimerisierungsversuche von 32 nur zur Bildung des HBr-Eliminierungsproduktes 33 führten, wurde das entsprechende Tosylat als Ausgangsstoff eingesetzt. Überraschenderweise entstand nicht das erwartete Diazocinodiindol-Ringgerüst, sondern ausschließlich ein isomeres, noch nicht bekanntes 6,7,14,15-Tetrahydro-15aH-azocino[1,2-a:6,5-b]diindol-Ringsystem 35. Die Bildung des neuen unsymmetrischen Ringsystems ist auf den ambidenten Charakter des Indolylanions zurückzuführen, das entweder am Sticksoff oder an C3 alkyliert werden kann. Umsetzung von 35 nach Mannich lieferte das bisaminoalkylierte Produkt 37, neben einer kleinen Menge der monoalkylierten Verbindung 36. Die Totalsynthese des zweiten Ringsystems ist im Schema 25 dargestellt. Um potentere Verbindungen zu erhalten, wurden beide Endstufen 6 bzw. 37 mit Methyliodid zu 14 bzw. 38 quaternisiert. 37 wurde zusätzlich mit Allylgruppen zu 39 substituiert. Die pharmakologische Testung von 14, 37, und 38 erfolgte über Radioligandbindungsstudien an Membransuspensionen der Herzventrikel des Hausschweins. Der allostere Effekt der Testverbindungen wurde über die Hemmung der Dissoziation von [3H]-N-Methylscopolamin([3H]-NMS) von den damit gesättigten Rezeptoren gemessen. Die erhaltenen EC50,diss-Werte geben die Konzentration des allosteren Modulators an, bei der die [3H]-NMS-Dissoziation auf die Hälfte des Kontrollwertes reduziert ist. Sie sind ein Maß für die Affinität der Testsubstanzen zur allosterischen Bindungsstelle des M2 Rezeptors. Für die einzige Verbindung mit dem Diazocinodiindole-Ringsystem 14 wurde ein EC50,diss-Wert von 54 nM gemessen. Da 14 über vier Benzylsubstituenten verfügt, kann seine Bindungsaffinität am besten mit der von Dibenzylcaracurinium-Dibromid verglichen werden, die ganz ähnlich ist (69 nM). Aufgrund der Tatsache, dass die Verkleinerung des NSubstituenten am Caracurin-V-Gerüst zur erheblichen Steigerung der allosterischen Potenz führte, ist zu erwarten, dass der Austausch der voluminösen Benzylgruppen von 14 durch z.B. Methyl- oder Allylsubstituenten, eine deutliche Affinitätssteigerung bewirken würde. Damit scheint die allosterische Potenz des neuen Ringsystems mindestens genauso gut zu sein, wie die von Caracurin V. Die beiden Vertreter des Azocinodiindol-Ringsystems, 38 und 39, sind bereits mit den Gruppen substituiert, die die beste allosterische Potenz bei dem Caracurin-V-Ringsystem zeigten (Methyl- und Allyl). Ihre EC50,diss-Werte (35 nM für 38, 48 nM für 39) sprechen jedoch für eine ca. 4-fach schwächere Bindungsaffinität als die der entsprechenden Caracurine, was vermutlich auf einen anderen Abstand zwischen den quartären Stickstoffatomen und eine andere relative Stellung der Indolaromaten in den beiden Ringsystemen zurückzuführen ist. Anders als die entsprechenden Caracurin-V-Salze, sind 38 und 39 negativ kooperativ mit dem Antagonisten [3H]NMS. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass von den beiden neu synthetisierten heterocyclischen Ringsystemen das direkt von Caracurin V abgeleitete Tetrahydro- [1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]diindol eine bessere und vielversprechende Leitstruktur für die Entwicklung neuer potenter allosterischen Liganden des M2-Rezeptors darstellt. Weitere synthetische Arbeiten an dem Ringsystem wie z.B. Variation des Sticksstoffsubstituenten und der Seitenkettenlänge sollten zu einer Steigerung der Bindungsaffinität in den subnanomolaren Bereich führen. Darüber hinaus sind die Ergebnisse der pharmakologischen Testung an dem muskulären Typ des nicotinischen Acetylcholinrezeptors abzuwarten.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Würzburg

Year

2003

Contributors dc:contributor

• Holzgrabe, Ulrike

• Allosterisch Modurator
• Muscarinrezeptor
• Tetrahydro[1
• 5]diazocino[1
• 2-a:6
• 5-a']diindol
• Tetrahydro-15aH-azocino[1
• 5-b']diindol
• Allosteric Modulator
• Muscarinic receptor
• 5-a']diindole
• 5-b']diindole

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